Lnc01287/miR-4500通過TGF-β/Smad通路影響特發性肺纖維化進展的相關機制

薛成 林益華 史永紅

廈門大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科361000

特發性肺纖維化是呼吸內科的疑難病,可由微生物感染、吸入粉塵及顆粒、結締組織病等引起。患者可出現漸進性的呼吸困難,最終導致死亡,對患者的工作和生活造成極大危害。它的病理基礎為各種因素導致肺泡上皮的慢性損傷,造成肺瘢痕成纖維細胞的大量增生,合成大量的膠原纖維,最終導致肺結構的重塑和肺纖維化的產生[1]。因此,對肺瘢痕成纖維細胞過度增生的機制研究已成為特發性肺纖維化研究的熱點。

LncRNA 為一類不編碼蛋白質的長鏈RNA,通常通過miRNA 及信號通路對細胞的生物學行為起 重 要 的 調 控 作 用[2]。 轉 化 生 長 因 子 β(transforming growth factor-β,TGF-β)/Smad通路是與纖維化密切相關的一條信號通路,與心、肺、肝、腎等器官的纖維化密切相關[3]。Lnc RNA很可能也通過調控miRNA 進而影響TGF-β/Smad通路的活化,最終促進人肺瘢痕成纖維細胞的增殖。本研究首先通過原代培養人肺成纖維細胞與人肺瘢痕成纖維細胞,研究Lnc01287、miR-4500、TGF-β/Smad通路在2種細胞中的表達;再通過基因相互作用預測網站與雙熒光素酶報告基因實驗,研究Lnc01287、miR-4500、TGF-β/Smad 通路間的相互作用關系;最后通過基因過表達與抑制技術,研 究Lnc01287/miR-4500 通 過TGF-β/Smad通路對人肺瘢痕成纖維細胞增殖的調控,以期為發現治療特發性肺纖維化的靶點、減緩此病的進展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗標本 本研究獲得了廈門大學附屬第一醫院倫理委員會的批準 (批號2020-02),實驗標本取自健康者與穩定期的特發性肺纖維化患者。健康者為經我院體檢,沒有任何基礎病,且自愿提供標本的志愿者。穩定期的特發性肺纖維化患者為在我科就診,高分辨率CT 提示肺間質纖維化,生命體征平穩,且排除了結締組織病、粉塵吸入、藥物引起等明確的病因。所有入組人員均簽署了知情同意書,最終入組4名健康者與4例穩定期的特發性肺纖維化患者。氣管鏡下用活檢鉗分別夾取對照組和實驗組的氣道黏膜組織。

1.2 實驗細胞 將上述對照組和實驗組的氣道黏膜組織清洗干凈后,分別加入含20%特級胎牛血清的高糖DMEM 培養基,進行原代培養,由于成纖維細胞為優勢細胞,隨著培養時間的延長,視野中只剩下人肺成纖維細胞與人肺瘢痕成纖維細胞,待細胞呈90%融合后,進行傳代,取3～6代的細胞進行后續的實驗。

1.3 實驗材料與儀器 高糖DMEM 培養基、特級胎牛血清、胰酶購自美國Hyclone公司,Trizol購自美國Life Technologies 公司,Lnc01287、miR-4500引物購自生工生物工程 (上海)股份有限公司,逆轉錄與實時熒光定量PCR 試劑盒購自日本Takara公司,人TGF-β 酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司,細胞裂解液與BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司,GAPDH、Smad3抗體購自英國Abcam公司,PVDF 膜購自北京索萊寶科技有限公司,ECL發光液購自美國Millipore公司,Lnc01287、TGFBR1 wt及mut熒光素酶質粒與Lnc01287、miR-4500、TGFBR1高低表達質粒購自上海吉瑪制藥技術有限公司,細胞轉染試劑盒購自美國Thermo Fisher公司,雙熒光素酶報告基因實驗試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,MTT 細胞增殖檢測試劑盒購自凱基生物科技發展有限公司。細胞培養箱購自新加坡ESCO 公司,生物顯微鏡購自日本Olympus 公司,逆轉錄與實時熒光定量PCR 儀購自美國Applied Biosystems公司,酶標儀購自雷杜生命科學股份有限公司,條帶曝光成像儀購自美國General Electric公司。

1.4 細胞轉染 將人肺瘢痕成纖維細胞按1.5×105/皿的密度接種在6 cm 培養皿中,待細胞呈50%左右融合后,根據細胞轉染試劑盒的說明書,加入轉染試劑和質粒,分為9 組。第1 組為對照組,第2 組 為Lnc01287 mimic 組,第3 組 為miR-4500 inhibitor組,第4 組為TGFBR1 mimic組,第5組為si-Lnc01287組,第6組為miR-4500 mimic組,第7 組為si-TGFBR1 組,第8 組為Lnc01287 mimic+miR-4500 mimic組,第9 組為miR-4500 inhibitor+si-TGFBR1組。37 ℃細胞培養箱培養8 h后,換完全培養基繼續培養,直至細胞長滿,生物顯微鏡下觀察細胞的形態,有代表性的圖片進行拍照。

1.5 實時定量PCR 實驗 將3～6代的人肺成纖維細胞與人肺瘢痕成纖維細胞以2×105/孔的密度接種在6孔板中,培養48 h后,加入Trizol,裂解細胞,再分別加入氯仿、異丙醇,提取RNA,用乙醇清洗RNA,將提純的RNA 溶解在DEPC 水中,檢測RNA 的濃度與純度,質檢合格后,取相同量的RNA,根據逆轉錄與實時熒光定量PCR 試劑盒的說明書,進行實時定量PCR,計算并比較2種細胞Lnc01287 與miR-4500 的拷貝數,實驗至少重復3次。

1.6 ELISA 取等量的人肺成纖維細胞與人肺瘢痕成纖維細胞上清液,根據人TGF-βELISA 試劑盒的說明書,依次加入標準品、樣品、抗體、酶、顯色劑,用酶標儀分別檢測標準品及樣品的吸光度,制作標準曲線,計算并比較2 種細胞TGF-β的量,實驗至少重復3次。

1.7 蛋白質印跡實驗 將上述人肺成纖維細胞與人肺瘢痕成纖維細胞及轉染后的9組細胞用胰酶消化,離心,棄上清,加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液,充分裂解后,提取總蛋白。BCA 法測定蛋白 濃 度, 制 膠, 上 樣, 電 泳, 轉 膜, 封 閉,GAPDH、Smad3一抗孵育,洗膜,二抗孵育,洗膜,曝光,用Image J檢測每個條帶的灰度值。以GAPDH 為內參,計算Smad3 與GAPDH 灰度的比值,比較人肺成纖維細胞與人肺瘢痕成纖維細胞及上述各組細胞Smad3的蛋白量,實驗至少重復3次。

1.8 基因相互作用預測 對于Lnc01287 與miR-4500的相互作用及結合位點預測,采用LncBase v.2 (http:／／carolina.imis.athena-innovation.gr／diana_tools／web／index.php？r=lncbasev2%2Findex)。對于miR-4500與TGFBR1的相互作用及 結 合 位 點 預 測,采 用targetscan.org (http:／／www.targetscan.org／vert_71／)。

1.9 雙熒光素酶報告基因實驗 將3～6代的人肺瘢痕成纖維細胞以105/孔的密度接種在12 孔板中,16 h后分別轉染miR-4500陰性對照及過表達質粒,Lnc01287、TGFBR1野生型及miR-4500結合位點突變型熒光素酶質粒,分為兩大組,第一大組的4 個小組為Lnc01287 wt+miR-4500 NC、Lnc01287 mut+miR-4500 NC、Lnc01287 wt+miR-4500 mimic、Lnc01287 mut + miR-4500 mimic,第二大組的4 個小組為TGFBR1 wt+miR-4500 NC、TGFBR1 mut+ miR-4500 NC、TGFBR1 wt+miR-4500 mimic、TGFBR1 mut+miR-4500 mimic。轉染48 h 后,裂解細胞,取上清,按雙熒光素酶報告基因實驗的說明書,加入熒光底物和終止液,酶標儀檢測并比較每大組的4個小組間熒光素酶反應強度,實驗至少重復3次。

1.10 MTT 實驗 將上述轉染后的9組人肺瘢痕成纖維細胞以4×103/孔的密度接種在96孔板中,培養24 h后,換無血清培養基,再培養24 h。根據MTT 細胞增殖檢測試劑盒的說明書,加入MTT,37 ℃孵育4 h,再加入DMSO,震蕩搖勻,酶標儀在550 nm 處檢測每個孔的吸光度,繪制細胞的增殖曲線,實驗至少重復3次。

1.11 統計學分析 采用SPSS 21.0進行統計分析。數據均以±s表示,兩組間比較采用t檢驗,三組及以上比較采用方差分析,柱形圖繪制采用GraphPad Prism 5。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2 種細胞Lnc01287 和miR-4500 表達的比較 實時定量PCR 實驗顯示,相比人肺成纖維細胞,人肺瘢痕成纖維細胞Lnc01287 是高表達的(P＜0.01),而miR-4500 是 低 表 達 的 (P＜0.05)。見圖1、2。

圖1 人肺成纖維細胞與人肺瘢痕成纖維細胞Lnc01287相對表達量的比較

圖2 人肺成纖維細胞與人肺瘢痕成纖維細胞miR-4500相對表達量的比較

2.2 2種細胞TGF-β、Smad3的比較 ELISA 結果顯示,相比人肺成纖維細胞,人肺瘢痕成纖維細胞TGF-β是高表達的(P＜0.05),見圖3。蛋白質印跡結果顯示,相比人肺成纖維細胞,人肺瘢痕成纖維細胞Smad3 是高表達的 (P＜0.05),見圖4。以上這些結果提示,相比人肺成纖維細胞,人肺瘢痕成纖維細胞TGF-β/Smad通路是活化的。

圖3 人肺成纖維細胞與人肺瘢痕成纖維細胞TGF-β濃度的比較

圖4 人肺成纖維細胞與人肺瘢痕成纖維細胞Smad3相對表達量的比較 A:蛋白印跡條帶;B:柱狀圖

2.3 Lnc01287、miR-4500 的靶基因預測LncBase v.2顯 示,Lnc01287 與miR-4500 可 能 存在相互作用,Lnc01287的靶基因可能是miR-4500(圖5)。Targetscan.org 顯 示,miR-4500 與TGFBR1可能存在相互作用,miR-4500的靶基因可能是TGFBR1 (圖6)。雙熒光素酶報告基因實驗顯示,對于Lnc01287 wt 組,相比miR-4500 NC,miR-4500 mimic的雙熒光素酶反應強度降低(P＜0.05),而對于Lnc01287 mut組,兩者間的雙熒光素酶反應強度差異無統計學意義 (圖7);對 于 TGFBR1 wt 組, 相 比 miR-4500 NC,miR-4500 mimic的雙熒光素酶反應強度明顯降低(P＜0.01),而對于TGFBR1 mut組,兩者間的雙熒光素酶反應強度差異無統計學意義(圖8)。

圖5 Lnc01287與miR-4500的相互作用位點

圖6 miR-4500與TGFBR1的相互作用位點

圖7 雙熒光素酶報告基因實驗驗證Lnc01287 與miR-4500間存在相互作用

圖8 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-4500與TGFBR1間存在相互作用

2.4 各組人肺瘢痕成纖維細胞中Smad3表達的比較 對于以上轉染的9組細胞來說,相比對照組,Lnc01287 mimic 組 與 miR-4500 inhibitor 組 的Smad3 蛋 白 表 達 量 明 顯 增 加 (P＜0.01),TGFBR1 mimic組的Smad3蛋白表達量增加(P＜0.05),si-Lnc01287 組 與miR-4500 mimic 組 的Smad3 蛋 白 表 達 量 明 顯 減 少 (P＜0.01),si-TGFBR1組的Smad3 蛋白表達量減少 (P＜0.05),Lnc01287 mimic+ miR-4500 mimic 組、miR-4500 inhibitor+si-TGFBR1組的Smad3蛋白表達量與對照組比較差異無統計學意義 (圖9)。以上這些結果提示,Lnc01287通過抑制miR-4500,對TGF-β/Smad通路起激活作用。

圖9 各組人肺瘢痕成纖維細胞Smad3蛋白相對表達量的比較 A:蛋白印跡條帶;B:柱狀圖

2.5 各組人肺瘢痕成纖維細胞形態的比較 相比對照組,Lnc01287 mimic組、miR-4500 inhibitor組及TGFBR1 mimic組的細胞數量更多,細胞間隙更小;而si-Lnc01287組、miR-4500 mimic組及si-TGFBR1組的多數細胞收縮變圓,細胞間隙增大,細胞貼壁不緊,脫落下來;Lnc01287 mimic+miR-4500 mimic組與miR-4500 inhibitor+si-TGFBR1組中,細胞又恢復典型的長梭形,細胞數量也較之前增加,細胞間隙減小(圖10)。

2.6 各組人肺瘢痕成纖維細胞增殖指數的比較MTT 實驗顯示,相比對照組,Lnc01287 mimic組的細胞增殖指數增加 (P＜0.05),miR-4500 inhibitor組及TGFBR1 mimic組的細胞增殖指數明顯增加 (P值均＜0.01),而si-Lnc01287組與miR-4500 mimic組的細胞增殖指數減少 (P值均＜0.05),si-TGFBR1組的細胞增殖指數明顯減少 (P＜0.01),Lnc01287 mimic+ miR-4500 mimic組、miR-4500 inhibitor+si-TGFBR1 組的細胞增殖指數與對照組比較差異無統計學意義。見圖11。

3 討論

肺間質纖維化是一種慢性進展性的肺疾病。它的病因有很多,包括吸入煙霧、重金屬、農藥、化肥、硅塵、病毒感染、遺傳變異性因素、特發性等[4]。其中的特發性肺纖維化為病因不明的肺間質纖維化,其發病率逐年升高,目前在歐洲和北美的發病率為0.002 8%～0.018%[5],在亞洲和南美的發病率為0.000 5%～0.004 2%。患者最常見的表現為呼吸困難,呈進行性加重,最終導致呼吸衰竭及死亡,給患者的日常工作和生活帶來極大危害。本病治療棘手,預后不佳,目前主要的治療手段為對癥治療,但無法有效地減緩疾病的進展,患者從診斷到死亡的中位生存期為2～4年[6]。因此,本病越來越引起呼吸內科工作者的重視。

特發性肺纖維化的發病機制尚不十分清楚,目前認為是遺傳因素與環境因素相互作用的結果。在各種不明因素的作用下,肺泡上皮細胞反復慢性損傷,導致肺成纖維細胞轉化為肺瘢痕成纖維細胞,分泌大量的細胞外基質,反過來又促進更多肺瘢痕成纖維細胞的生成,形成一個正反饋的惡性循環[7],最終導致肺組織的重塑、肺順應性的下降及氣體交換能力的損害。很多通路的活化參與這一過程,包括Wnt/β-catenin 通 路[8]、TGF-β/Smad通路、Sonic hedgehog通路等,那么,是什么原因導致了這些通路的活化,上游是否有一些始動因子參與,需要進一步研究。

Lnc RNA 與miRNA 是一類非編碼RNA,雖然不編碼蛋白質,但卻對人體的許多生物學功能起重要的調控作用。Lnc RNA 通常通過抑制miRNA的表達,對信號通路起正向的調控作用[9],最終影響機體的生物學功能。

關于Lnc01287,目前的研究不多。關于miR-4500,目前很多研究證實其可作為抑癌基因,可抑制多種腫瘤的進展,如肝癌[10]、非小細胞肺癌[11]等。唯一與纖維化相關的是Kudo等[12]的研究,他們發現miR-4500的過表達可以降低膠原的穩定性,抑制纖維化的進展。

圖10 各組人肺瘢痕成纖維細胞形態的比較

圖11 各組人肺瘢痕成纖維細胞增殖指數的比較

TGF-β/Smad通路是一條與纖維化密切相關的通路,與許多器官(如腎、肝、肺、心)的纖維化密切相關。這條通路的主要因子是TGF-β、TGFBR1、Smad3,當細胞間質中的TGF-β 與受體TGFBR1結合后,這條通路被激活,胞質中的Smad3活化,轉位到細胞核,與纖維化相關靶基因結合,促進基因的轉錄[3]。在糖尿病腎病小鼠模型中,敲除TGF-β或Smad3能夠抑制腎小管上皮細胞的間質轉化,降低波形蛋白的表達水平,顯著地減緩腎纖維化的進展[13]。TGF-β與Smad3能導致肝星狀細胞的活化,產生過多的細胞外基質,促進肝纖維化的進展[14]。在肺纖維化小鼠模型中,抑制TGF-β/Smad通路的活化能夠減緩疾病的進展[15]。在心肌纖維化中,TGF-β/Smad 通路是活化的,導致心肌成纖維細胞的增生與膠原Ⅰ分泌的顯著增加[16]。那么,Lnc01287 是否通過抑制miR-4500的表達,進而增強TGF-β/Smad通路的活性,最終促進人肺瘢痕成纖維細胞與特發性肺纖維化的進展呢? 這是本研究需要解決的問題。

本研究證實,在人肺瘢痕成纖維細胞中,Lnc01287、TGF-β/Smad 通 路 是 高 表 達 的,而miR-4500是低表達的。Lnc01287可能通過作用于miR-4500,抑制它的表達,miR-4500的低表達又作用于TGFBR1,激活TGF-β/Smad 通路,導致Smad3表達增加,增強人肺瘢痕成纖維細胞的增殖活性,最終促進特發性肺纖維化的進展。因此,Lnc01287是治療特發性肺纖維化的很有希望的靶點,可針對此開發治療特發性肺纖維化的藥物,有效地減緩此病的進展。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突