miR-25通過(guò)靶向BCL2L11在膿毒癥致AKI細(xì)胞模型中發(fā)揮保護(hù)性作用

吳 斌,王美堂

膿毒癥是由感染因素引起的最致命的全身性炎癥綜合征，可引起休克、多器官功能障礙綜合征，甚至死亡[1]。急性腎損傷（acute kidney injury,AKI）是膿毒癥最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[2]。如果能在AKI早期進(jìn)行干預(yù)，可顯著降低膿毒癥患者的病死率[3]。因此，研究膿毒癥致AKI的病理生理改變機(jī)制，尋求有效治療手段是一個(gè)亟待研究的課題。

miRNAs是一類非編碼RNA，通過(guò)抑制翻譯或降解mRNA來(lái)負(fù)調(diào)控基因表達(dá)[4]。目前關(guān)于miRNAs在膿毒癥腎損傷中的研究較少[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-204可通過(guò)抑制核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）途徑活化，抑制脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）誘導(dǎo)的RMCs細(xì)胞損傷[6]，miR-107則可通過(guò)誘導(dǎo)TNF-α分泌，加重腎小管上皮細(xì)胞損傷[7]。上述研究提示miRNAs在膿毒癥致AKI的發(fā)生、發(fā)展中起著重要調(diào)節(jié)作用。先前研究發(fā)現(xiàn)miR-25在膿毒癥患者體內(nèi)表達(dá)下調(diào)[8]。Yao等[9]發(fā)現(xiàn)miR-25通過(guò)靶向PTEN抑制膿毒癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。然而，miR-25是否膿毒癥致AKI的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。因此，本研究通過(guò)建立LPS誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）損傷的細(xì)胞模型體外模擬AKI研究miR-25的保護(hù)性作用，旨在為臨床治療膿毒癥致AKI提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 HK-2細(xì)胞購(gòu)自上海富衡生物科技有限公司。胎牛血清、青霉素-鏈霉素、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑及TaqMan-MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。MiR-25模擬物（miR-25 mimic）、miR-25抑制劑（miR-25 inhibitor）和陰性對(duì)照物（negativecontrol,NC）購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，過(guò)表達(dá)BCL2L11質(zhì)粒（pc-BCL2L11）及空載質(zhì)粒（vector）均由上海生工生物工程有限公司負(fù)責(zé)構(gòu)建。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（Cell counting kit-8,CCK-8）購(gòu)自日本Dojindo公司。RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR熒光定量試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司。熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司。蛋白強(qiáng)裂解液、發(fā)光顯影液、抗體稀釋液購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，包括：B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,BCL-2，ab32124,1:1000）、BCL-2相 關(guān) 的X基 因 （BCL2-Associated X,Bax,ab53154,1∶1000）、 剪切的半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3,ab32042,1∶1000）、cleaved Caspase-9（ab2324,1:1000）和 β-肌動(dòng)蛋白（β-actin,ab8226,1:2000）。BCL-2樣蛋白11（BCL-2-likeprotein 11,BCL2L11,#374358,1∶1000）抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培育與處理 使用含10%胎牛血清、1%青霉素（100 U/ml）和鏈霉素（100μg/ml）的DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37°C，相對(duì)濕度，含5%CO2的培養(yǎng)箱進(jìn)中行細(xì)胞培養(yǎng)。 用不同濃度（0、1、2、4、6、8和10μg/ml）LPS處理HK-2細(xì)胞12 h摸索LPS誘導(dǎo)AKI細(xì)胞模型的濃度。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)說(shuō)明書(shū)，使用Lipofectamine 3000試劑分別將miR-25 mimic、miR-25 inhibitor、NC、pc-BCL2L11及Vector轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染72 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性變化 當(dāng)HK-2細(xì)胞（104個(gè)細(xì)胞/孔）分別完成pc-BCL2L11、miR-25 mimic、miR-25 inhibitor轉(zhuǎn)染和LPS刺激時(shí)，利用CCK-8評(píng)估細(xì)胞活力。將10μl CCK-8加入至細(xì)胞細(xì)胞液中并繼續(xù)培養(yǎng)3 h，后用分光光度計(jì)測(cè)量450 nm處的吸光度。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT PCR）檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)水平 根據(jù)試劑說(shuō)明，使用Trizol試劑提取HK-2細(xì)胞中的總RNA。使用分光光度計(jì)定量mRNA濃度后，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，后用SYBR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)熒光水平，使用β-actin作為內(nèi)參基因，2-ΔΔCT方法計(jì)算進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。采用TaqMan-MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaqManmiRNA分析對(duì)miRNA表達(dá)進(jìn)行定量，U6被用作內(nèi)參基因進(jìn)行計(jì)算。引物序列見(jiàn)表1。

1.6 熒光素酶報(bào)告基因分析 根據(jù)說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)，將BCL2L11基因的野生型（wild-type,wt）和突變型（mutant-type,mut）的3'UTR片段克隆到pGL3熒光素酶報(bào)告載體中。將HK-2細(xì)胞（2×104細(xì)胞/ml）接種于6孔培養(yǎng)板上，次日用Lipofectamine（Invitrogen）將報(bào)告質(zhì)粒和miR-25 mimic共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。采用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)染72 h后的熒光素酶活性。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)炎癥因子水平將處理后的HK-2細(xì)胞上清液進(jìn)行定量，根據(jù)說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

1.8 蛋白印跡法（Western blot）檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)水平 收集HK-2細(xì)胞沉淀，并用RIPA蛋白裂解液（已添加蛋白酶抑制劑）進(jìn)行溶解。將提取的蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下，在5%脫脂牛奶中封閉1 h后，將膜與一抗在4℃下培養(yǎng)過(guò)夜。次日洗滌后，用與HRP結(jié)合的相應(yīng)二抗在室溫下孵育膜2 h，最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光溶液在成像系統(tǒng)中進(jìn)行熒光定量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次，數(shù)據(jù)用平均值（mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。應(yīng)用SPSS 22.0軟件（美國(guó),SPSS）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組或多組間的比較采用Student t檢驗(yàn)或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 miR-25抑制LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡和增殖阻滯 用0、1、2、4、6、8和10μg/ml LPS處理HK-2細(xì)胞可使其細(xì)胞活力水平在LPS處理下同樣以劑量依賴性方式降低（P＜0.05）；不同濃度LPS處理HK-2細(xì)胞還可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)miR-25呈劑量依賴性降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-25 mimic后，細(xì)胞表達(dá)miR-25水平均明顯升高（P＜0.05），相反轉(zhuǎn)染miR-25 inhibitor后，miR-25水平均顯著下降（P＜0.05），從而驗(yàn)證了miR-25 mimic及inhibitor的有效性；與LPS誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)miR-25的HK-2細(xì)胞經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞活性顯著增加，而轉(zhuǎn)染miR-25 inhibitor的細(xì)胞呈相反表現(xiàn)。見(jiàn)表3。

Western blot結(jié)果（表4）示，與LPS誘導(dǎo)損傷組細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)miR-25的細(xì)胞表達(dá)促凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-3均顯著降低（P＜0.05），而抑制凋亡蛋白BCL-2表達(dá)顯著增高（P＜0.05），轉(zhuǎn)錄miR-25 inhibitor則有相反的變化（P＜0.05）。

2.2 miR-25減輕LPS對(duì)HK-2細(xì)胞的炎癥損傷HK-2細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-25可逆轉(zhuǎn)LPS刺激HK-2細(xì)胞后IL-6、IL-1β 和TNF-α 濃度的增加（P＜0.05），而當(dāng)細(xì)胞低表達(dá)miR-25時(shí)，則具有相反的效果（P＜0.05）。 見(jiàn)表5。

2.3 過(guò)表達(dá)BCL2L11逆轉(zhuǎn)miR-25介導(dǎo)的對(duì)LPS誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞炎癥和凋亡的抑制作用 使用TargetScan軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)BCL2L11的3'UTR序列與miR-25互補(bǔ)（圖1）。為驗(yàn)證此觀點(diǎn)，檢測(cè)熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-25模擬物可顯著降低野生型（Wt）BCL2L11 3'UTR的熒光素酶活性（P＜0.05），而突變型（Mut）3'UTR的熒光素酶活性（P＞0.05），見(jiàn)表6。另外，當(dāng)細(xì)胞過(guò)表達(dá)或者低表達(dá)miR-25時(shí)，BCL211L蛋白水平會(huì)隨之降低或者升高（P＜0.05），見(jiàn)表7。通過(guò)將BCL2L11過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和miR-25 mimic轉(zhuǎn)染到這些細(xì)胞中，Western blot結(jié)果（表8）示細(xì)胞轉(zhuǎn)染BCL2L11后該蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05），提示質(zhì)粒有效性。細(xì)胞過(guò)表達(dá)BCL2L11可顯著逆轉(zhuǎn)miR-25對(duì)LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡和炎癥的影響（P＜0.05）。見(jiàn)表9。

圖1 使用TargetScan預(yù)測(cè)miR-25和BCL2L11之間的結(jié)合位點(diǎn)

3 討論

本研究經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-25過(guò)表達(dá)可靶向BCL2L11，降低其表達(dá)水平，并可抑制凋亡和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，提示miR-25可能參與了膿毒癥致AKI的進(jìn)展。

表2 不同LPS處理濃度對(duì)K-2細(xì)胞活性及mi R-25表達(dá)水平的影響（? s）

表2 不同LPS處理濃度對(duì)K-2細(xì)胞活性及mi R-25表達(dá)水平的影響（? s）

注：以不同濃度（0、1、2、4、6、8和10 μg/ml）LPS處理HK-2細(xì)胞12 h。與對(duì)照組（0 μg/ml）比較，①P ＜ 0.05

組別 0 1 2 4 6 8 10細(xì)胞活性（%） 99.67±5.01 77.00±3.01 67.70±2.46 60.87±2.50 54.67±3.07 42.63±4.26 miR-25表達(dá)水平 1.12±0.11 0.92±0.06 0.77±0.06 0.64±0.06 0.51±0.07 0.34±0.10 0.16±0.06

表3 miR-25與LPS共同處理對(duì)HK-2細(xì)胞活性的影響(? s )

表3 miR-25與LPS共同處理對(duì)HK-2細(xì)胞活性的影響(? s )

注：與對(duì)照組（Control）或NC組比較,①P ＜ 0.05

組別 Control NC mimic inhibitor Control NC mimic inhibitor未處理 LPS（8 μg/ml）miR-25水平 0.99±0.06 1.01±0.06 0.36±0.08 0.73±0.07 0.70±0.10 3.86±0.55 0.19±0.08 細(xì)胞活性（%） 98.17±6.17 96.67±4.83 99.43±4.51 99.27±5.18 53.30±3.63 50.60±1.97 73.90±5.82 26.27±4.06

表4 miR-25與LPS共同處理對(duì)HK-2細(xì)胞表達(dá)蛋白的影響(? s)

表4 miR-25與LPS共同處理對(duì)HK-2細(xì)胞表達(dá)蛋白的影響(? s)

注：與Control組比較，①P ＜ 0.05；與LPS+NC組比較，②P ＜ 0.05

組別 Control LPS LPS+NC LPS+mimic LPS+inhibitor 0.17±0.04 Bax/β-actin 0.16±0.05 0.93±0.07 1.01±0.10 0.23±0.07 1.08±0.16 Cleaved Caspase-3/β-actin 0.19±0.05 1.06±0.15 1.08±0.15 0.17±0.12 1.01±0.19 Cleaved Caspase-0/β-actin 0.20±0.10 0.96±0.13 0.97±0.13 0.23±0.10 0.98±0.26

表5 各組細(xì)胞炎癥因子水平比較(? s )

表5 各組細(xì)胞炎癥因子水平比較(? s )

注：與Control組比較，①P ＜ 0.05；與LPS+NC組比較，②P ＜ 0.05

組別 IL-6 (pg/ml) IL-1β( pg/ml) TNF-α(pg/ml) 475.00±35.76 893.67±85.62 LPS+NC 611.67±22.55 465.00±61.88 905.67±74.84 LPS+miR-25 mimic 271.00±38.74 145.67±14.01 303.33±26.58 LPS+miR-25 inhibitor 813.00±35.59 697.67±34.56 1110.67±95.51

表6 熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證結(jié)合靶點(diǎn)(? s )

表6 熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證結(jié)合靶點(diǎn)(? s )

注：與NC組比較，①P ＜ 0.05

組別 NC mimic NC mimic熒光素酶活性 1.05±0.06 1.00±0.07 Wt-BCL2L11 Mut- BCL2L11

表7 miR-25對(duì)細(xì)胞表達(dá) BCL2L11蛋白水平的影響(? s)

表7 miR-25對(duì)細(xì)胞表達(dá) BCL2L11蛋白水平的影響(? s)

注：與Control組比較，①P ＜ 0.05，與LPS+NC組比較，②P ＜ 0.05

組別 Control LPS LPS+NC LPS+mimic LPS+inhibitor BCL2L11蛋白水平 0.17±0.06 1.09±0.12 0.38±0.06 1.16±0.06

表9 miR-25與BCL2L11共表達(dá)對(duì)HK-2細(xì)胞活性、炎癥因子釋放及蛋白表達(dá)水平的作用(? s）

表9 miR-25與BCL2L11共表達(dá)對(duì)HK-2細(xì)胞活性、炎癥因子釋放及蛋白表達(dá)水平的作用(? s）

注：與LPS+NC+Vector組比較,④P ＜ 0.05；與LPS+miR-25 mimic+Vector組比較,⑤P ＜ 0.05

組別 LPS+NC+Vector LPS+NC+pc-BCL2L11 LPS+mimic+Vector LPS+mimic+pc-BCL2L11

表8 BCL2L 11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染有效性驗(yàn)證(? s)

表8 BCL2L 11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染有效性驗(yàn)證(? s)

注：與對(duì)照組比較,①P ＜ 0.05

組別 Control Vector pc-BCL2L11 BCL2L11表達(dá)水平 0.34±0.09 0.33±0.08

凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，參與了敗血癥致AKI的發(fā)生[10]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)HK-2細(xì)胞miR-25過(guò)表達(dá)后，LPS刺激細(xì)胞表達(dá)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase 3和Caspase 9減少，而B(niǎo)CL-2增加。因此，本研究推測(cè)miR-25過(guò)表達(dá)可能通過(guò)抑制內(nèi)源性凋亡途徑，對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的AKI起到保護(hù)作用。促炎癥反應(yīng)在膿毒癥致AKI的發(fā)病機(jī)制中占重要地位。本研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激HK-2細(xì)胞可使其表達(dá)促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平顯著升高，而細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-25時(shí)，可發(fā)揮其抗炎特性，降低上述4種細(xì)胞因子的水平。

越來(lái)越多的研究通過(guò)miRNAs可靶向調(diào)節(jié)目的基因發(fā)揮[11]。本研究證明miR-25可負(fù)調(diào)控BCL2L11表達(dá)基于BCL2L11抑制的研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)BCL2L11可逆轉(zhuǎn)miR-25過(guò)表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)HK-2損傷的影響，提示miR-25對(duì)LPS誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷的影響是通過(guò)調(diào)節(jié)BCL2L11實(shí)現(xiàn)的。已知BCL2L11屬于BH3家族，是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[12]。既往尚無(wú)研究報(bào)道BCL2L11與膿毒癥致AKI的關(guān)系，因此本研究將為未來(lái)進(jìn)一步探討B(tài)CL2L11的作用提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)HK-2損傷時(shí)，miR-25呈低表達(dá)水平。過(guò)表達(dá)miR-25可通過(guò)靶向抑制BCL2L11，減少炎癥因子產(chǎn)生和抑制凋亡反應(yīng)的發(fā)生，從而減輕LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷。