基于拉曼光譜的成團泛菌快速鑒別

宋 莉，張 孟，李 悅，郝澤壯，丁長虹，趙 妍，周長龍，段明華

微生物污染了藥品，會將藥品中的主要活性成分破壞，使得藥品失去作用效果并產生不良反應。所以，對藥品進行微生物限度檢查是控制和監測藥品質量的重要指標[1]。《中國藥典》規定了控制藥品中存在的微生物范圍：霉菌、酵母菌、細菌和控制菌[2-3]。

成團泛菌，屬腸桿菌，革蘭陰性菌，黃色黏性[4]。可從水果、植物或種子中分離獲得[5-6]。 在臨床上，由成團泛菌感染引起的疾病稱為成團泛菌敗血癥，此證為急癥，病情嚴重，臨床表現為畏寒，高熱，病人體溫可達到39℃以上[7]。

截至目前，有一系列方法可用于菌株鑒定，主要包括：菌落培養后的形態學觀察、革蘭染色觀察和生化反應判定。這些方法繁瑣，耗時長，且只能對菌株進行初步鑒定。而且，確定菌株僅僅依靠一種鑒定方法是遠遠不夠的，必須結合幾種方法對菌株進行鑒定，才能得出相對準確的結論。因此，從不同角度和儀器自動化層面對菌株進行鑒定，并綜合不同的鑒定方法對菌株進行定性判定成為控制藥品質量的重要環節。

本實驗從3個角度對成團泛菌進行了鑒別，應用BD Phoenix M50細菌鑒定藥敏分析儀對成團泛菌進行種屬鑒別[8-9]，微生物鑒定飛行時間質譜儀對成團泛菌中的蛋白質進行鑒別[10-13]，共聚焦顯微拉曼色譜儀對成團泛菌表面物質進行掃描鑒別[14-15]。通過3個層面的鑒別，以期實現對成團泛菌科學準確的定性，從而控制藥品質量，保證人民用藥安全。

1 材料與方法

1.1 儀器 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基（青島高科技工業園海博生物技術有限公司，批號：20201222）；電熱恒溫培養箱（揚州慧科電子有限公司，型號：GHP-9162）；微生物鑒定及藥敏分析系統（美國BD公司，型號：BD Phoenix M50）；微生物飛行時間質譜儀（江蘇天瑞儀器股份有限公司福建公司，型號：JJF1528-2015）；共聚焦顯微拉曼光譜儀（RENISHAWRinVia Raman Microscop,型號：Gloucestershire,UK）。

1.2 培養方法

1.2.1 成團泛菌培養 藥品在進行微生物限度檢測時，在檢測目標菌沙門菌的培養板中，發現在XLD（木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂）培養基中有黃色黏性菌落生長，與沙門菌菌落形態判定不一致，所以懷疑藥品中存在其他微生物，為了藥品的安全性，對該可疑菌落進行進一步純化與鑒定。

在無菌超凈工作臺內，采用接種針挑取單顆菌落，在XLD培養基平皿中劃線，然后放置于（36±1）℃恒溫培養箱中，培養24 h，觀察結果。根據觀察結果進行初步判斷，然后應用BD Phoenix M50細菌鑒定藥敏分析儀對該菌的種屬進行鑒別，應用飛行時間質譜儀對細菌的蛋白質進行鑒別，應用共聚焦顯微拉曼光譜儀對菌落拉曼光譜進行掃描鑒別。

1.3 鑒定方法

1.3.1 BD Phoenix M50細菌鑒定藥敏分析儀鑒定可疑菌落 根據進行的革蘭染色結果，確定該菌為革蘭陰性菌，所以在進行細菌鑒定時，選取革蘭陰性板卡進行實驗。從XLD培養基上挑取單一菌落，放置于鑒定肉湯管，配制菌懸液，混合均勻。應用Phoenix比濁儀監測菌濃度，使得空白鑒定肉湯管最終菌濃度為0.5～0.6麥氏單位，60 min內使用。取革蘭陰性板卡，使用無熒光的標記筆在板卡上進行標記，將板卡放置于加樣盤上，將鑒定菌懸液連續傾倒于板卡內，使菌懸液充滿每一個反應孔。用密封蓋將板卡封住，將加樣完成后的板卡在30 min內放入BD Phoenix M50細菌鑒定藥敏分析儀進行檢測。應用鑒定板轉移器進行鑒定板轉移，并保持直立狀態。

1.3.2 JJF1528-2015飛行時間質譜儀鑒定成團泛菌（1）基質液配制(1.0 ml)稱取15.0 mgα-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）放置于體積為1.5 ml的離心管中，向其中依次加入乙腈500μl、去離子水475μl和三氟乙酸25μl。渦旋震蕩2～3 min，常溫或置于4℃保存，有效期為1～2 w。（2）70%甲酸配制(10.0 ml)：吸取7 ml甲酸放置于體積為15.0 ml的離心管中，向其中加入蒸餾水3.0 ml，充分混勻，常溫或置于4℃，避光保存。（3）波譜采集：用10.0μl規格的移液槍頭挑取菌體，適量即可。均勻涂抹在靶點內，向其中滴加70%甲酸1.0μl，晾干。再滴加基質液1.0μl覆蓋樣品，晾干后進行圖譜采集。

1.3.3 成團泛菌拉曼光譜掃描 （1）白光成像：設置共聚焦顯微拉曼光譜儀(RENISHAWRinVia Raman Microscop,Gloucestershire,UK)的參數，白光成像過程中，需要調整顯微鏡放大倍數，以獲得一個較清晰的視野[16]。（2）拉曼光譜掃描：將光譜掃描設置為靜態掃描，掃描波長785 nm，掃描的光譜中心位置為500 cm-1。獲得的掃描圖譜如果沒有光譜峰，說明設置的laser power較弱；如果出現了虛線光譜峰，說明設置的laser power過高，信號已經飽和。在設定的參數條件下，對成團泛菌進行靜態拉曼光譜掃描[17]。

1.4 統計學方法 應用Graphpad Prism 5.0軟件進行統計分析，計量資料以x±s表示，采用t檢驗及單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌純化培養 在XLD培養基中對可疑菌落進行純化培養，結果見圖1，菌落呈黃色，有粘性。

2.2 BD Phoenix M50細菌鑒定藥敏分析儀鑒定BD Phoenix M50細菌鑒定藥敏分析儀在分析細菌對不同生化底物所產生的發熒光的物質，通過讀數器測定熒光強度來判定細菌胞外酶；讀取數值后，自動將所測取的數據與存儲在硬盤中的菌種資料庫標準菌生物模型相比較，由電腦分析得出的結果做出鑒定。鑒定結果見表1，根據鑒定結果，將可疑菌落定性為成團泛菌。

2.3 微生物飛行時間質譜 未知微生物通過它們各自的峰列表與數據庫的比較來鑒定。依據確定的質量數和它們的強度的相關性生成一個匹配值，這個值用來對結果進行排序。

表1 成團泛菌生化特性檢測

應用JJF1528-2015飛行時間質譜儀對成團泛菌進行進一步鑒定，鑒定結果見圖2。綜合分析，并與數據庫進行比對，鑒定結論為成團泛菌，儀器設備給定分數1.5以上為鑒定成功，此次檢定結果得分為1.97分，鑒定結果可信。

圖1 XLD培養基中菌落純化培養

圖2 成團泛菌飛行時間質譜儀鑒定質譜

2.4 拉曼光譜掃描

2.4.1 成團泛菌白光成像 對空白培養基和成團泛菌分別進行白光成像，見圖3（A、B），A為空白培養基白光成像圖，B為成團泛菌白光成像圖 。

2.4.2 成團泛菌拉曼光譜掃描 在設定的掃描參數下，對空白培養基和成團泛菌進行靜態掃描，獲得單一成分拉曼特征指紋圖譜。可以看出，成團泛菌的拉曼特征峰主要集中在100～1100 cm-1光譜范圍內，在970 cm-1，1010 cm-1，附近處均出現明顯的特征峰，見圖3（C、D）。

3 討論

以往許多研究表明，通過外觀觀察、生化反應或單一的鑒別方法對可疑菌落得出的鑒別結論，可能會出現誤差甚至錯誤，從而影響對微生物的判定，影響藥品安全性。

在本實驗研究中，首先對可疑菌落在XLD培養基中進行了純化培養，應用BD Phoenix M50細菌鑒定藥敏分析對菌落進行了生物化學鑒定，初步鑒定為成團泛菌。然后應用飛行時間質譜儀，對細菌內的蛋白質進行峰歸屬，進一步確定其為成團泛菌。最后應用共聚焦顯微拉曼光譜儀，對成團泛菌表面物質進行了拉曼光譜掃描，獲得拉曼特征吸收峰。

藥品進行微生物檢測過程中[18-19]，必須證明使用的試劑對微生物無毒性。同時，在操作過程中，必須控制檢驗過程染菌，否則影響結果判定。

細菌鑒定藥敏分析方法對操作步驟要求嚴格，菌懸液配制的濃度以及應用時限都有嚴格規定。這樣就對檢驗人員的業務素養和能力提出了一定的要求，該方法實現了對菌株種屬的鑒定[20-21]。

微生物飛行時間質譜在檢測過程中，菌株涂抹不可過厚，否則不能真實反應檢測結果。該方法對菌株中的蛋白質進行峰歸屬檢測，檢測物質的分子量范圍較大，同時掃描速度快[22-23]。

圖3 成團泛菌拉曼光譜掃描

拉曼光譜技術在建立成團泛菌拉曼特征指紋圖譜的過程中，將拉曼色譜峰作為鑒別不同菌株的指標。該方法能夠科學、細致、準確地實現菌株的快速鑒別[24-25]。

綜上所述，本實驗從通過3種不同的方法由表及里對可疑菌落進行了準確科學的判定，得出了正確的結論，有利于藥品安全和人民用藥健康。