基于生物信息學(xué)分析鑒定肝細(xì)胞癌預(yù)后生物標(biāo)志物

何春梅 莫之婧

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在惡性腫瘤死亡中排名居前列[1-4]。由于HCC通常發(fā)生在受損的肝臟中，因此復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差。目前，臨床指導(dǎo)建議和方針都無法完全反映HCC預(yù)后的影響[2]。生物標(biāo)志物對惡性腫瘤的診斷、檢測和預(yù)后具有重要的作用，通過預(yù)測與鑒定癌癥的侵襲性并評估生存率能夠預(yù)測特定癌癥對特定治療的反應(yīng)程度[3]。因此，本研究綜合利用GEO數(shù)據(jù)庫、STRING、Cytoscape、DAVID和GEPIA等軟件篩選出與HCC預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物，為HCC的分子機制研究和預(yù)后提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、數(shù)據(jù)來源

本研究芯片數(shù)據(jù)下載NCBI的GEO 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)含有448個樣本的GSE14520數(shù)據(jù)集，包含GPL571平臺和GPL3921平臺。其中GPL571平臺有19例癌旁組織樣本和22例人肝癌細(xì)胞組織樣本；GPL3921平臺有220例正常肝臟樣本和225例人肝癌細(xì)胞組織樣本。

二、差異基因的篩選

在GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE14520數(shù)據(jù)集兩個平臺的基因表達矩陣。利用GEO 數(shù)據(jù)庫中的GEO2R篩選差異表達基因(differentially expressed genes，DEG)，篩選條件為adj.P.Value<0.05，|logFC|>1.5。用韋恩圖求出GPL571和GPL3921兩個平臺表達量上調(diào)與下調(diào)的差異基因的交集，得出GSE14520數(shù)據(jù)集兩個平臺共有的DEG。

三、蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)模塊分析

由韋恩圖交集得出共有的DEG上傳到STRING (http://string-db.org/)網(wǎng)絡(luò)分析，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)，Cytoscape軟件中的MCODE插件從PPI中識別網(wǎng)絡(luò)模塊，排列最前的兩個蛋白互作模塊，用CytoHubba插件計算全部節(jié)點的度(degree)并排序，篩選出位于網(wǎng)絡(luò)中心區(qū)域的關(guān)鍵基因。

四、GO和KEGG通路富集分析

運用DAVID數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵基因進行KEGG和GO分析，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選條件。

五、GEPIA數(shù)據(jù)分析

利用在線網(wǎng)絡(luò)GEPIA(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)TCGA數(shù)據(jù)庫中的LIHC數(shù)據(jù)集，分析關(guān)鍵基因在HCC中的表達及與HCC患者總生存率/無病生存率的相關(guān)性。

結(jié) 果

一、篩選差異表達基因

從GSE14520數(shù)據(jù)集GPL571和GPL3921兩個平臺篩選到的DEG分別為706個(上調(diào)DEG 195個，下調(diào)DEG 511個)、518個(上調(diào)DEG 133個，下調(diào)DEG 385個)，將兩個平臺的DEG取交集，共得到91個上調(diào)差異基因、257個下調(diào)差異基因(圖1)。

二、蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)與分析

將348個DEG輸入STRING構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape 軟件中的MCODE插件從中篩選出排列最前的兩個蛋白互作模塊：模塊1和模塊2。結(jié)果顯示模塊1由 40個節(jié)點和738條邊組成，均為上調(diào)DEG；模塊2由32個節(jié)點和202條邊組成，均為下調(diào)DEG。用CytoHubba插件分別計算模塊1和模塊2中節(jié)點的度(degree)并排序(圖2)，排列越前的基因顏色越深，且位于網(wǎng)絡(luò)中心區(qū)域。結(jié)果顯示模塊1中位于網(wǎng)絡(luò)中心區(qū)域的關(guān)鍵基因有AURKA、CDK1、CCNB1、TYMS、BUB1B、EZH2、CDC20、CDKN3、TTK、TPX2、TOP2A、KPNA2、NUSAP1、RFC4、ASPM、NCAPG 、SMC4、BIRC5、MELK、ZWINT、CENPF、FEN1、RRM2、MCM2、KIAA0101、MCM3、HMMR、PRC1、DTL共29個；模塊2中位于網(wǎng)絡(luò)中心區(qū)域的關(guān)鍵基因有HRG、HGD、TAT、AGXT、CYP1A1、C8A、FTCD、SPP2、ALDH8A1、AOX1、KLKB1、F9、MBL2、NR1I2、FETUB、CY2E1、UGT2B15共17個。

注：紅色和綠色分別代表上調(diào)和下調(diào)的基因(HCC組織相對與正常對照)，灰色點代表在腫瘤和癌旁組織中表達差異不顯著明顯的基因。圖1 GSE14520數(shù)據(jù)庫中的GPL571和GPL3921兩個平臺顯著DEGs的火山圖

圖2 模塊1的DEG在MCODE識別的網(wǎng)絡(luò)模塊(左)及模塊2的DEG在MCODE識別的網(wǎng)絡(luò)模塊(右)

三、關(guān)鍵基因的GO和KEGG通路富集分析

將網(wǎng)絡(luò)模塊1中的關(guān)鍵基因進行聚類分析，前10個顯著GO和KEGG分析顯示模塊1中的DEG主要參與細(xì)胞分裂，有絲分裂、有絲分裂細(xì)胞周期的G2/M轉(zhuǎn)換、DNA復(fù)制等生物過程；細(xì)胞核、核質(zhì)、中間體、紡錘體和細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞組成；ATP結(jié)合和蛋白質(zhì)結(jié)合等分子功能；細(xì)胞周期信號通路(表1)。

表1 模塊1關(guān)鍵基因的GO和KEGG Pathway注釋

將網(wǎng)絡(luò)模塊2中的關(guān)鍵基因進行聚類分析，前10個顯著GO和KEGG分析顯示模塊2中的DEG主要參與環(huán)氧酶P450途徑、氧化還原和類固醇代謝等生物過程；細(xì)胞外體、細(xì)胞器膜等細(xì)胞組成；鐵離子結(jié)合、血紅素結(jié)合、氧化還原酶活性作用于成對的供體等分子功能；代謝途徑、補體和凝血級聯(lián)等信號通路(表2)。

四、關(guān)鍵基因在肝細(xì)胞癌及癌旁正常組織中的表達

文獻分析顯示模塊1中的關(guān)鍵基因已有相關(guān)研究在肝細(xì)胞癌中開展，而模塊2關(guān)鍵基因中的HAAO、HGD、PROZ、KLKB1、FETUB和 F9在肝細(xì)胞癌中的作用還未見報道。將篩選出的這6個基因通過GEPIA分析驗證其在TCGA數(shù)據(jù)庫中的表達情況。結(jié)果表明PROZ和F9在肝細(xì)胞癌組織的表達顯著低于正常組織(圖3)。

圖3 HAAO,HGD,PROZ,KLKB1,FETUB,F9在肝癌組織和正常組織表達差異

五、關(guān)鍵基因與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系

將上述篩選出的6個關(guān)鍵基因通過GEPIA分析其表達高低與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示HGD、PROZ和F9低表達患者總生存率(P<0.05)(圖4)，及無病生存率(P<0.05)均低于高表達患者(圖5)。

圖4 HGD,PROZ ,F9基因表達肝癌患者總生存率的關(guān)系

圖5 HGD,PROZ,F9基因表達與肝癌患者無病生存率的關(guān)系

討 論

本研究利用GSE14520數(shù)據(jù)集，共篩選出348個差異表達基因，其中91個上調(diào)基因，257個下調(diào)基因。從PPI中篩選出排列最前的2個重要網(wǎng)絡(luò)模塊。模塊1中的關(guān)鍵基因主要參與DNA復(fù)制與細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換。大量研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞周期異常調(diào)控密切相關(guān)，模塊1中的CDK1、CCNB1、AURKA、TYMS處于蛋白互做網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中心，GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白參與細(xì)胞周期信號通路和細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換生物過程。相關(guān)研究表明，CDK1、CCNB1、AURKA和TYMS基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切的相關(guān)性。CDK1是細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)控因子[5]。CCNB1編碼的蛋白位細(xì)胞周期蛋白1，CDK1/CCNB1在LINC00346競爭吸附miR-199a-3p的作用下上調(diào)，調(diào)控肝癌細(xì)胞的凋亡、侵襲和細(xì)胞周期，進而影響HCC發(fā)生發(fā)展[6]。AURKA的下調(diào)通過p-GSK-3β/β-連環(huán)蛋白途徑失活來抑制血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞增殖，進而抑制主動脈夾層動脈瘤(ADA)的發(fā)生發(fā)展[7]。TYMS基因的下調(diào)促進了細(xì)胞周期由G1期進入S期，進而抑制了腹膜后脂肪肉瘤(RLPS)的進展。最近研究表明，細(xì)胞周期蛋白不僅通過影響腫瘤細(xì)胞，還通過影響其微環(huán)境，在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮額外的作用，如通過調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)[8]，這些結(jié)果提示，CDK1、CCNB1、AURKA、TYMS可能通過調(diào)控細(xì)胞周期進程或HCC微環(huán)境來影響HCC的發(fā)生、發(fā)展，其分子機制值得我們深入研究。

本研究網(wǎng)絡(luò)模塊2中的關(guān)鍵基因主要參與氧化還原生物過程。肝癌細(xì)胞在有氧條件下仍能進行活躍的葡萄糖攝取和糖酵解過程，同時減少Q(mào)XPHOS過程，這種特殊生化表型在HCC的生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)中占有重要地位，如肝癌組織內(nèi)MPC功能障礙可能與HCC糖異生功能下降及糖酵解代謝增強有關(guān)[9]。模塊2關(guān)鍵基因中的HGD和HAAO基因參與氧化還原的生物過程，KLKB1基因參與氧化還原酶活性，作用于成對的供體上，并結(jié)合或還原分子氧的生物過程，F(xiàn)9參與酶原激活和肽基谷氨酸羧化的生物過程，PROZ基因參與肽基谷氨酸羧化生物過程，F(xiàn)ETUB基因主要參與內(nèi)肽酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)和半胱氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑的活性的分子功能。這些結(jié)果提示HGD、HAAO、KLKB1、F9、PROZ和FETUB可能通過降低氧化還原酶活性、酶原激活和肽基谷氨酸羧化等生物過程降低檸檬酸循環(huán)，需氧氧化磷酸化等氧化還原過程來促進糖酵解，進而促進肝細(xì)胞癌的進展。

通過GEPIA分析驗證發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵基因中的PROZ和F9在肝細(xì)胞癌組織的表達顯著低于正常組織，此外，HGD、PROZ和F9低表達與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后差異顯著相關(guān)。HGD基因突變會引起HGD酶的缺乏，進而導(dǎo)致組織中的同型半胱氨酸(HGA)沉積，導(dǎo)致嚴(yán)重的骨關(guān)節(jié)病、堿尿癥和心臟瓣膜退變等疾病[10,11]。在一種新的小鼠模型中分析證實，HGD基因僅在肝臟和腎臟皮質(zhì)中表達，且表明肝臟HGD對HGA代謝至關(guān)重要，肝臟可能是未來AKU酶/基因治療的合適靶點[12]。有文獻表明，抑制HAAO增加內(nèi)源性3-HAA水平，降低血脂水平和動脈粥樣硬化，導(dǎo)致肝臟SREBP-2mRNA水平降低，并改善肝臟病理評分，然而，HAAO在HCC的具體機制仍不清楚[13]。F9基因變異導(dǎo)致相應(yīng)凝血因子完全或部分缺失，最終導(dǎo)致嚴(yán)重程度不一的B型血友病，剪接體成分U1snRNP錯誤地結(jié)合在F9基因的3′UTR內(nèi)，導(dǎo)致下游PAS的抑制和F9 mRNA的強烈下降,進而導(dǎo)致蛋白水平降低和凝血活性降低[14]。目前，還沒有報道表明F9在HCC中的作用。Z(PROZ)基因編碼肝臟維生素K依賴性糖蛋白，該蛋白在肝臟中合成并分泌到血漿中，PROZ基因與腦梗死、細(xì)菌性腦膜炎發(fā)病機制、中國漢族女性反復(fù)自然流產(chǎn)的遺傳易感性、特應(yīng)性皮炎和胰腺癌的發(fā)生密切相關(guān)[15-16]。有研究表明，轉(zhuǎn)染miR-24和miR-34a的HEPG2細(xì)胞不僅降低了肝細(xì)胞核因子4α(HNF4a)，而且還降低了PROZ的轉(zhuǎn)錄水平[17]，但其在HCC中的具體作用有待進一步探索。

本研究通過生物信息學(xué)分析篩選出的基因PROZ和F9在肝癌組織和正常組織表達差異有顯著性，且低表達患者總生存率及無病生存率均低于高表達患者，具備一定的肝細(xì)胞癌預(yù)后評估價值，有助于醫(yī)生對肝細(xì)胞癌患者手術(shù)后個體化治療方案的選擇提供幫助，但其在肝細(xì)胞癌中的生物學(xué)功能及作用機制有待進一步的研究。