紫外線輻射對海帶配子體克隆的影響

趙聚萍 羅世菊 李曉捷 王利芹

摘 要：為確定海帶（Saccharina japonica）配子體紫外線輻射的適合劑量范圍，利用紫外線對東方海洋種質庫保存的2個海帶配子體克隆系進行輻射試驗。通過三次預試驗，輻射條件設置為：輻射距離12 cm，輻射時間分別為10、20、30、40、50、60、90、120 s。結果顯示：輻射時間10、20 s配子體細胞未發生明顯變化，但受輻射影響，克隆約2個月的時間不生長;輻射時間30 s細胞存活率約為50%～55%;隨著輻射時間的增加，細胞死亡增多;輻射時間120 s下，兩個克隆系只有極個別細胞存活。在輻射距離12 cm時，輻射時間10～120 s作用范圍內，雄配子體耐受力明顯高于雌配子體。

關鍵詞：誘變育種;紫外線輻射;海帶（Saccharina japonica）;配子體

海帶（Saccharina japonica）屬于冷水性大型海藻，是我國海水養殖的重要經濟藻類，在我國養殖面積很廣。從上世紀50年代開始，我國開始進行海帶大規模人工養殖，經過幾十年的發展，目前已經形成了較為成熟的養殖技術體系和較為完善的產業鏈[1]。配子體克隆技術的建立，使海帶的種質得以長久保存，并且通過配子體雜交技術培育海帶新品種，解決了傳統育苗育種選育周期長、優良性狀容易退化等問題。為了豐富育種素材，采用物理誘變等方式誘導海帶配子體產生變異，能縮短獲得優良變異植株的時間。

海帶常規育種方法有定向選擇、誘變、雜交結合連續自交等。由于常規育種方法自然突變的發生率低[2]，因此經常利用物理、化學等誘變手段，提高突變率，加速育種進程。紫外線輻射是物理誘變的一種，具有操作安全、簡單、對環境污染小等優點。紫外線輻照影響DNA的復制和轉錄，引起基因突變和染色體畸變，產生各種各樣的變異[3]。目前，在農業生產上，已有多個利用紫外線輻射誘變育種的報道[4-7]。

本研究利用紫外線對種質庫保存的2個配子體克隆系進行4次輻射試驗，通過觀察輻照后海帶配子體細胞狀態及細胞死亡情況，判斷紫外線輻射對海帶配子體的作用范圍，以確定海帶配子體紫外線輻射的適合劑量范圍，為豐富育種素材，進一步進行海帶紫外線輻射育種提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用的材料為山東東方海洋科技股份有限公司海藻實驗室中保存的海帶配子體克隆RC571104004（♀）、RC571104005（♂）共2個克隆系。

1.2 試驗方法

將2個克隆系的克隆分別用厚玻璃板壓磨，將壓磨后的克隆經400目篩絹過濾，得到1～4個細胞的細胞段濾液，倒入直徑9 cm的培養皿中，預培養5～7 d。用預培養后的克隆進行試驗。將15 W紫外線燈管固定在低溫冷藏箱內，冷藏箱溫度為8～12 ℃。將培養皿內的水倒掉，放在紫外線燈管下輻射，輻射完成后，加入低溫培養液，將培養皿放入培養箱內暗光下培養，培養箱溫度為8～12 ℃。65 d后，轉入弱光下培養，光照強度為6～10 μmol·m-2·s-1，光照周期為L∶D=24 h∶0。每天換水、鏡檢一次，觀察克隆狀態。

試驗首先對試驗輻射距離與輻射時間進行探索，預試驗的輻射距離與輻射時間見表1。預試驗結果表明在輻射距離為6 cm和12 cm;輻射時間為240～600 s的情況下，4～5 d時絕大部分細胞死亡;40～45 d時試驗組細胞全部死亡。當輻射距離為12 cm;輻射時間為60、120 s的情況下，9 d時部分細胞開始死亡;25 d時絕大部分細胞死亡，但克隆系之間與輻射組別之間均無差異;60 d時試驗組的存活細胞開始逐漸恢復生長。通過這三次預試驗，重新設置試驗：輻射距離為12 cm，輻射時間為：10、20、30、40、50、60、90、120 s，以不輻射的樣本為對照。試驗每個輻射劑量設3個平行，對照組3個平行。

2 結果

輻射完成后，每天鏡檢輻射克隆。不同鏡檢時間觀察對照組均生長正常，沒有明顯變化。輻射組前期鏡檢沒有明顯變化;15 d鏡檢部分輻射組出現死亡;50 d鏡檢各輻射組死亡情況趨于穩定。輻射時間30 s組，雌、雄兩個克隆系細胞存活率均約為50%～55%;90 d鏡檢各輻射劑量存活細胞開始生長。♀♂兩個克隆系不同鏡檢時間鏡檢結果見表2，♀♂各輻射劑量存活情況見表3，♀♂各輻射劑量存活情況趨勢圖見圖1。

3 討論

試驗材料的處理：先將海帶配子克隆利用厚玻璃板壓磨，過濾，得到1～4個細胞的細胞段濾液，預培養5～7 d，待克隆附著牢固，細胞狀態恢復后進行輻射。首先試驗考慮到紫外線輻射的穿透性，避免因克隆細胞重疊，照射不到，影響試驗結果;其次待克隆狀態恢復后進行輻射，避免因壓磨對克隆細胞的損傷影響試驗結果。

從試驗結果可以看出，利用15 W紫外線燈管對海帶配子體克隆進行輻射，輻射距離為12 cm時，輻射時間10、20 s配子體細胞未發生明顯變化，但受輻射影響，克隆約2個月的時間不生長;輻射時間30 s細胞存活率約為50%～55%;隨著輻射時間的增加，細胞死亡增多;輻射時間120 s下，兩個克隆系只有極個別細胞存活。

輻射時間長時，雌、雄兩個克隆系均沒有存活細胞，雌、雄配子體沒有明顯區別;在輻射距離12 cm時，輻射時間10～120 s作用范圍內，海帶雄配子體受輻射后表現晚于雌配子體，且細胞存活率高于雌配子體，因此海帶雄配子體對紫外線的耐受力明顯高于雌配子體。紫外線輻射時冷藏箱溫度為8～12 ℃，進行試驗操作時動作迅速，輻射完成后加入低溫培養液等均為減少人為操作對試驗結果的影響。另外，海帶配子體自身的狀態、外部環境等因素可能對試驗結果有一定的影響。

紫外線輻射可能誘導海帶配子體產生大量變異，對輻射后的海帶配子體克隆進行擴增培養、海帶配子體克隆育苗，期待能在較短時間內獲得具有優良性狀的變異植株，分離、保存與優良性狀相關的新基因;還可以結合海帶配子體克隆細胞雜交技術獲得數量多、種類多的突變植株[8]。同時，利用海帶配子體克隆培養方法分離和培養目標植株的配子體細胞，可以作為新的海帶遺傳資源進行保存，豐富海帶種質資源庫。另外，紫外線輻射操作安全、簡單，在實驗室內就可以進行，不需要特殊儀器，因此還可以嘗試對海帶孢子體、海帶幼苗進行輻射，觀察其突變情況，以期獲得新的具有優良性狀的變異植株。

參考文獻：

[1] 劉福利，王飛久，孫修濤，等.分子育種及其在海帶育種中的研究進展[J].海洋科學，2012，36（9）：128-134.

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Effects of ultraviolet radiation on the gametophyte clones of Saccharina japonica

ZHAO Juping， LUO Shiju， LI Xiaojie， WANG Liqin

（Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd.， National Algae and Sea Cucumber Engineering and Technique Research Center， Shandong Algae and Sea Cucumber Technology Innovation Center， Shandong Key Laboratory of Genetic Improvement & Efficient Culture of Marine Alage， Yantai 264003， China）

Abstract：Four ultraviolet radiation experiments were carried out on two gametophyte clones of Saccharina japonica， preserved in the germplasm bank of Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd. to screen the suitable dose range of ultraviolet radiation for mutation breeding. After three pre-tests， the experiment was set 12 cm for radiation distance， and 10 s， 20 s， 30 s， 40 s， 50 s， 60 s， 90 s， 120 s for radiation time， respectively.The results showed that no cell survived when the radiation distance was 6 cm. The gametophyte cell did not change significantly for 10 s and 20 s when the radiation distance was 12 cm， but the clones did not grow during a period of approximately 2 months; the survival rates of clones were about 50%～55% for 30 s; the number of death cells increased with the increase of radiation time; only a few cells survived for 120 s. The tolerance of male gametophytes was significantly stronger than that of female gametophytes when the radiation distance was 12 cm and the radiation time was 10～120 s.

Key words：mutation breeding; ultraviolet radiation; Saccharina japonica;gametophyte

（收稿日期：2021-02-22;修回日期：2021-03-23）

基金項目：國家重點研發計劃“藍色糧倉科技創新”重點專項（2018YFD0901500）;現代農業產業技術體系專項資金（CARS-50）;煙臺市科技計劃項目（2018LJRC067）;山東省重點實驗室專項建設計劃（SDKL2017009）;山東省現代農業產業技術體系建設專項資金（SDAIT-26-11）。

作者簡介：趙聚萍（1983-），女，工程師，碩士，研究方向：海藻育種。E-mail：857946447@qq.com。