前茬作物對植煙土壤細菌多樣性及群落結構的影響

鄒 靜，黃 鶯，李熙全，昝建朋，張 權，明 堂，蒙 駿

（1. 貴州大學煙草學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省煙草品質研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3. 貴州省煙草公司安順市公司，貴州 安順 561000）

健康土壤是農產品數量和質量的重要保障。近年來，在集約化的農業生產中，土壤過度使用和不合理的管理制約了土壤生態系統服務功能。目前，較高的復種指數、單一的作物種植、藥肥過量施用等現狀，導致土壤微生物多樣性下降，微生物區系失衡，土傳病害增加，嚴重影響作物品質和產量[1]。土壤微生物的數量、活性、生理或行為的變化是反映土壤健康狀況的重要指標[2]。學者們常用土壤微生物量、生物多樣性、群落結構和功能基因表達等來反映土壤健康狀況[3-5]，為探討田間養分的轉化、土傳病害預防提供了可行方法。前人的研究表明，調整種植模式會改善土壤微生物多樣性、群落結構，減輕烤煙連作帶來的危害[6]；種植不同的作物會影響養分循環及供應，微生物群落結構也會因此改變[7]；王飛等[8]在研究翻壓不同綠肥對植煙土壤細菌類群影響時發現，翻壓綠肥的微生物多樣性顯著高于不翻壓綠肥的，翻壓不同的綠肥對作物產生的影響也不相同；祖偉軍等[9]從土壤微生物豐度與酶活性2個方面探討了翻壓綠肥對土壤的影響，得出翻壓綠肥可以提高土壤微生物的豐度，增加有關氮循環相關的酶活性等結論；劉勇軍等[10]發現添加了有機物料的土壤中部分酶活性提升、煙葉品質也得到改善。

當前貴州的耕地復種指數仍然較高，并且在短時間內這一情況不會改變。與此同時，農村產業結構的調整，促使烤煙前茬作物種類和耕作模式變化，烤煙種植制度正發生著變化。從傳統的“玉米或水稻—油菜—烤煙”種植模式轉變為“蔬菜—蔬菜或休閑—烤煙”模式，在此影響下，新的土壤微生物區系與結構必將重新構建。探明不同前茬作物對植煙土壤微生物群落多樣性的影響，篩選出有利于農田生態環境改善和烤煙產、質量提高的前茬種植模式，可為合理調整和優化配置植煙土壤的不同土地種植模式提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試地點和供試土壤

試驗于2019年在貴州省安順市西秀區楊武鄉進行。供試土壤為黃壤，其基本理化為：pH值5.95，有機質含量51.33 g/kg，堿解氮265.32 mg/kg，有效磷25.70 mg/kg，速效鉀168.55 mg/kg，容重0.91 g/cm3。

1.2 試驗設計

試驗選擇貴州冬季種植較為廣泛的作物參試，以冬閑為對照，共設置4個前茬處理，分別為：紫云英（KY1，綠肥翻壓還田）、黑麥草（KY2）、白菜（KY3）、冬閑（KY4，CK），每個處理3次重復。小區面積133.4 m2。

2019年10月15日整地并播種紫云英、黑麥草，同時進行白菜育苗，11月28日移栽白菜。紫云英、黑麥草、撂荒處理均不施肥，白菜處理在移栽7 d后施用尿素6.06 kg/667m2。作物栽培至2020年3月，3月17日采收白菜、黑麥草后整地，紫云英（綠肥）直接翻壓后整地。

1.3 土壤樣品采集

烤煙種植起壟施肥前，于2020年4月17日在每個小區用5點取樣法采集土壤樣品，采樣深度0～45 cm。土壤樣品采集以后立即放入預先滅菌的羊皮紙袋密封，放入冰盒暫存，帶回實驗室后放入超低溫冰箱（-80℃）保存，用于微生物多樣性研究。

1.4 土壤微生物DNA提取及測序

采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit從土壤樣品中提取細菌總基因組DNA，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，便于PCR擴增。細菌擴增區間為16S rDNA的V3～V4區，引物為515F（5'-GTGCCAGC MGCCGCGGTAA-3'）/806R（5'-GGACTACHVGGTW TCTAAT-3'）。PCR產物使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，使用膠回收試劑盒（QIAGEN公司）回收目的條帶。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，通過NovaSeq6000上機測序。

1.5 數據分析

對Illumina NovaSeq測序得到的數據進行質量控制，對原始數據進行拼接、過濾，利用Uparse軟件對所有樣本的全部有效序列進行聚類，按照97%的一致性將序列聚類成為OTUs，同時選取OTUs的代表性序列，生成OTU表格。用Mothur方法與SILVA132的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析獲得分類學信息，并按界門綱目科屬種統計各樣本的群落組成。細菌Alpha多樣性由Chao1指數、香農指數（Shannon）、辛普森指數（Simpson）、ACE指數表征。細菌群落結構間的差異采用除趨勢對應分析表征。

2 結果與分析

2.1 各處理土壤樣本細菌測序數據分析

經過高通量測序，共獲得307 226條高質量的有效序列，其中KY3處理的高質量有效序列最多為86 324條，KY2的最少，為72 656條；平均序列長度除KY4為414 nt外，其他處理均為415 nt；覆蓋率的范圍為98.6%～99.0%，說明樣品中絕大部分細菌的序列能夠被測出，可以反映細菌群落的真實情況（表1）。從圖1可以看出，隨著樣本容量和序列數的增加，OTU的增加速率逐漸減緩，然后會趨于平坦，即使檢測樣本量增多，也只會產生少量新的OTU，最終OTU總量趨于定值。這表明，取樣的數量及深度在一定程度上可以覆蓋整個群落。

表1 不同前茬作物土壤細菌測序數據統計

圖1 不同前茬作物土壤細菌稀釋曲線

由圖2可知，KY1、KY2、KY3、KY4處理的土壤樣品中OTU數量分別為3 479、3 183、3 321和3 356個，4個處理共有的OUT數量為2 144個，分別占各處理OUT總數的61.63%、67.36%、64.56%、63.89%。KY1、KY2、KY3、KY4處理特有的OUT數量分別為222、113、173、260個，依次占各處理OTU總數的6.38%、3.55%、5.21%、7.74%。其中KY4處理獨有OTU數量最多，預示著該處理樣本中含有較多的特有微生物種類。

圖2 不同前茬作物土壤細菌venn圖

2.2 不同前茬作物對植煙土壤細菌多樣性的影響

Alpha多樣性可分析樣品內菌種類別的豐富度和菌種數目的均勻度，Alpha多樣性越高，細菌種類越豐富，群落越穩定[11]。ACE指數和Chao1指數屬于豐富度指數，用于估計群落中含OTU數目的指數，群落物種的豐富度越高則其值越高[12]；辛普森、香農指數反映物種優勢度[13]。由表2中可知，KY1、KY2、KY3處理的辛普森指數差異不顯著，但是均顯著高于KY4，說明冬季土壤休閑后，細菌多樣性降低，分布不均勻；香農指數、Chao1指數、ACE指數也均以KY4處理的最低，但處理間無明顯差異；說明KY4土壤細菌群落結構及豐富度劣于其他處理。KY1的4項指數均最高，說明種植紫云英，且從綠肥的形式翻壓還田更有利于土壤微生物群落結構的穩定。

2.3 不同前茬作物處理下植煙土壤細菌組成的差異

相似的生態環境下，不同處理土壤細菌在門水平上具有較高的相似性，4個處理間相對豐度排名前10的優勢細菌所占比例均達到95%以上。盡管各優勢菌門所占比例有差異，但前10個優勢菌門在4個處理間是相同的（圖3），包括Proteobacteria（變形菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Gemmatimonadetes（芽單胞菌門）、Verrucomicrobia（疣微菌門）、Latescibacteria和unidentified Bacteria（未知細菌門），Others（其他）表示10個門之外的其他所有門的相對豐度之和；優勢菌門中以變形菌門和酸桿菌門為主，占總序列的54.81%～63.31%；酸桿菌門在KY4處理中占比僅為17.08%，顯著低于其余3個處理，但厚壁菌門在KY4處理中占比高于其他3個處理，但差異未達到顯著水平。

表2 不同前茬作物土壤細菌Alpha多樣性指標

圖3 不同前茬作物土壤細菌在門水平上的相對豐度

不同前茬作物導致土壤細菌在門水平上存在數量與種類的差異，4個處理中KY1的獨有菌門最多，有6種，分別是Candidatus Yanofskybacteria、Candidatus Jorgensenbacteria、Hydrogenedentes、Nitrospirae、Nitrospinae和Margulisbacteria；KY3有3個獨有菌門，分別為Euryarchaeota、Parcubacteria和Gracilibacteria；KY2與KY4無獨有菌門。

3 結論與討論

微生物群落結構受種植作物的影響[14]。現有不少研究已經證明，不同的土地利用方式、翻壓不同作物會影響土壤微生物所處的環境，從而導致其組成與豐度的差異，產生共有的或特異的群落結構[15-19]。

試驗結果表明，各處理土壤細菌物種數由高到低排列依次為KY1＞KY3＞KY4＞KY2，處理間差異不顯著；KY1、KY2、KY3處理的辛普森指數顯著高于KY4（冬閑，CK），說明對照處理的物種優勢度低；而各處理的香農指數、Chao1指數和ACE指數差異不顯著。

試驗結果還顯示，不同處理間土壤細菌均以變形菌門、酸桿菌門為主，這2種菌門都是土壤中較重要的菌門，其在土壤生物化學循環中起著重要作用[20]。變形菌門與根瘤菌的共生固氮密切相關[21]，研究中它是第一優勢菌門，可能是因為變形菌門是嗜養菌門，翻壓作物增加了土壤中有機質的含量，所以相對豐度較高。變形菌門可以提高土壤質量，促進植株生長[22]，而KY4的變形菌門相對豐度高于其他處理，可見人為干擾較少的土壤韌性高，與林耀奔等[23]研究不同土地利用方式對微生物群落結構的影響中的結論一致。酸桿菌門排名次之，因為酸桿菌門中含有豐富的編碼纖維素酶和淀粉水解酶的基因序列，所以可以分解動植物殘體，改善農田土壤碳循環[24]，取樣時土壤里植株殘體正是豐富的時候，酸桿菌門豐度自然較高。

研究還發現，KY1處理有6種特異菌門，分別為Candidatus Yanofskybacteria、Candidatus Jorgensenbacteria、Hydrogenedentes、Nitrospirae、Nitrospinae和Margulisbacteria；其 中，Nitrospirae與Nitrospinae是亞硝酸鹽氧化細菌，主要功能是能將亞硝氮轉為硝氮，推動氮循環[25-26]；Margulisbacteria主要參與氮還原、亞硝酸鹽還原、硫酸鹽還原，推動硫、氮、碳循環，說明種植紫云英促進了土壤氮循環，不僅通過固氮作用提高了土壤氮含量，還促使土壤氮的分解轉化，但是紫云英翻壓后的分解，可能會因消耗大量土壤氧氣而引起還原過程加??；Candidatus Yanofskybacteria、Candidatus Jorgensenbacteria和Hydrogenedentes等菌門目前為止還未鑒定出具體功能。KY3有3種獨有菌門，分別是Euryarchaeota、Parcubacteria和Gracilibacteria，其中Euryarchaeota含有產甲烷古菌和甲烷氧化古菌，是地球碳代謝循環的重要驅動力[27]，Parcubacteria和Gracilibacteria還未見在土壤功能方面的報道。

研究僅從微生物多樣性方面對烤煙前茬作物進行了探討，之后可以結合土壤理化性質進行綜合評價，選擇最優的烤煙前茬作物。另外，研究中發現的Candidatus Yanofskybacteria、Candidatus Jorgensenbacteria、Hydrogenedentes、Parcubacteria和Gracilibacteria這5種菌門的功能未見具體報道，之后可對其在土壤中的功能進行鑒定。