重金屬鎘對染菌蜘蛛的毒性作用

王雨卉，高 穎，李博雅，張 玥，李文浩，黃思琪，楊惠麟

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南 長沙 410128； 2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南 長沙 410128）

由于鎘（Cd）具有高生物毒性、強(qiáng)生物富集性、非生物降解性等特性，鎘污染對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的危害日趨嚴(yán)重[1-2]。鎘可以富集在蜘蛛體內(nèi)，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而對生物產(chǎn)生各種生理生態(tài)毒性[3-5]。機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，未清除的氧化劑引起細(xì)胞凋亡和病理損傷，甚至導(dǎo)致動物疾病和死亡[6-7]。生物體的抗氧化酶系主要包括超氧化物歧化酶（SOD），過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，可保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[8]。金屬硫蛋白（MT）與進(jìn)入機(jī)體內(nèi)的金屬離子結(jié)合，能清除自由基，具有重金屬解毒和抗氧化的雙重作用[9-10]。抗氧化酶活性與機(jī)體抗病免疫及生理代謝功能等方面相互影響，直接反映昆蟲的抗性狀態(tài)和生理機(jī)能[11-12]。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是廣泛存在于環(huán)境中的典型革蘭氏陽性菌致病菌。致病性大腸桿菌（Escherichia coli）是環(huán)境中最常見的革蘭氏陰性病源菌。蜘蛛周生被毛，極易攜帶各類病原菌，其體內(nèi)抗菌肽具有較強(qiáng)的抗菌免疫功能[13]。在自然環(huán)境中，蜘蛛常處于多種生物污染物和非生物污染物的協(xié)同污染之中。因此，探究重金屬與病原菌對蜘蛛機(jī)體生理功能產(chǎn)生的毒性影響具有較強(qiáng)的現(xiàn)實意義。擬環(huán)紋豹蛛（Pardosa pseudoannulata）是稻飛虱、稻葉蟬、稻縱卷葉螟等害蟲主要的捕食性天敵，也是南方稻田蜘蛛中的常年優(yōu)勢種[14]。筆者以擬環(huán)紋豹蛛為研究對象，通過果蠅飼喂法對擬環(huán)紋豹蛛進(jìn)行重金屬鎘處理，再采用針刺蘸取菌液法對試驗組（Cd）和對照組（CK）蜘蛛進(jìn)行S. aureus和E. coli創(chuàng)傷感染，探討重金屬鎘對染菌農(nóng)田蜘蛛的毒性作用，以期明晰鎘對染菌蜘蛛抗氧化酶活性等生理指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 果蠅和果蠅培養(yǎng)基

紅眼果蠅（Drosophila melanogaster）由湖南師范大學(xué)動物學(xué)實驗室提供。對照組培養(yǎng)基為玉米培養(yǎng)基。在對照組培養(yǎng)基中添加氯化鎘（AR，滿鑫商貿(mào)有限公司），配制成終濃度為1 mg/L的鎘培養(yǎng)基，作為試驗組培養(yǎng)基。分別用對照組培養(yǎng)基和試驗組培養(yǎng)基飼喂果蠅，待果蠅在培養(yǎng)基中生活15 d后用于喂食對應(yīng)組擬環(huán)紋豹蛛。

1.2 供試蜘蛛飼養(yǎng)及處理

擬環(huán)紋豹蛛（Pardosa pseudoannulata）采集于湖南省農(nóng)科院試驗田旁水塘周邊。取體型相近的擬環(huán)紋豹蛛雌蛛120只，每管一只蜘蛛分裝于試管內(nèi)，試管放入小團(tuán)濕潤棉花，試管口用棉花堵塞。所有蜘蛛饑餓處理24 h后備用。蜘蛛分為試驗組（Cd）和對照組（CK），每組60只，試驗組蜘蛛飼喂鎘試驗組培養(yǎng)基培養(yǎng)的果蠅，對照組飼喂未添加氯化鎘培養(yǎng)基培養(yǎng)的果蠅。蜘蛛在人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)（相對濕度80%～90%，溫度（25±1）℃，光照時間14 h/d）。每只蜘蛛每天飼喂果蠅8～10只。定時觀察和記錄擬環(huán)紋豹蛛的進(jìn)食和生存狀態(tài)，處理30 d。

1.3 抗菌物質(zhì)的誘導(dǎo)

金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均來自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生科院微生物學(xué)實驗室。配置S. aureus（3.0×104CFU/mL）和E. coli（3.0×104CFU/mL）菌懸液備用。采用針刺蘸取菌液法對試驗組（Cd）和對照組（CK）蜘蛛進(jìn)行創(chuàng)傷感染，染菌24 h后，取樣分裝置于－80℃保存，以備生理生化指標(biāo)的測量。

1.4 粗酶液提取

蜘蛛染菌24 h后，各組取蜘蛛數(shù)只，稱取蟲重約0.5 g，以0.01 mol/L的磷酸緩沖液（PBS）洗凈，冰浴勻漿，以 PBS 沖洗研缽，合并洗液，按 5 mL/g蟲重補(bǔ)足緩沖液，離心（5 000 r/min，10 min），上清液用于后續(xù)酶活檢測[15]。

1.5 鎘含量測定

每組樣品稱取0.5 g蜘蛛，先用1 %的硝酸對樣品表面清洗3次。將樣品放入50 mL消解管內(nèi)，加入5 mL HClO4和20 mL HNO3浸泡過夜，標(biāo)號，記錄。放入消解儀上，90℃消解1 h，150℃消解2 h，待白煙消散后升溫至 200℃繼續(xù)消解。待溶液至5 mL液體時，若有未消解組織則補(bǔ)加 2～3 mL HNO3，升溫至240℃繼續(xù)消解。待反應(yīng)液完全澄清或略帶白即消解完全。待溶液剩余約1 mL，取出過濾，冷卻定容到50 mL，用ICP電感耦合等離子光譜儀228.3 nm測定鎘含量。

1.6 生物活性物質(zhì)含量測定

可溶性蛋白含量使用Bradford蛋白質(zhì)試劑盒采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[16]測定，可溶性糖含量采用改進(jìn)的蒽酮法[17]測定，抗氧化活性物質(zhì)采用試劑盒測定，金屬硫蛋白（MT）采用ELISA 試劑盒測定，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化（SOD）、過氧化物酶（CAT）采用分光光度計法測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2010和 SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理和統(tǒng)計學(xué)分析。將P＜0.05和P＜0.01分別定義為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異和極顯著性差異。試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean ± SD）表示，采用Bonferroni法進(jìn)行多重比較，采用GraphPad prism 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)Cd含量測定

經(jīng)鎘處理30 d后，試驗組擬環(huán)紋豹蛛與對照組一起進(jìn)行染菌處理。染菌24 h后，采用ICP法檢測蜘蛛體內(nèi)鎘含量。由表1可知，試驗組（Cd）蜘蛛的鎘含量極顯著高于對照組（CK）蜘蛛。

2.2 鎘脅迫對染菌蜘蛛能量物質(zhì)含量的影響

由圖1可知，蜘蛛感染S. aureus和E. coli后，試驗組蜘蛛體內(nèi)的可溶性糖含量顯著高于對照組，尤其是感染S. aureus試驗組蜘蛛體內(nèi)可溶性糖含量高達(dá)156.07 μg/mL；與對照組相比，試驗組蜘蛛體內(nèi)可溶性蛋白含量均極顯著降低。這表明可溶性糖和可溶性蛋白在染菌蜘蛛對抗鎘毒性過程中發(fā)生了差異性響應(yīng)。鎘顯著影響染菌蜘蛛體內(nèi)的能量物質(zhì)含量。

2.3 鎘脅迫對染菌蜘蛛抗氧化酶活性的影響

機(jī)體的抗氧化酶系包括SOD、CAT和GSH-Px等，金屬硫蛋白（MT）也是重要的解毒和抗氧化活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)是反映機(jī)體對抗氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)。從圖2可知，鎘顯著影響了染菌擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)抗氧化酶系和MT的活性。圖2A表明，與對照組相比，鎘脅迫顯著提升了染菌蜘蛛體內(nèi)SOD的活性，S.aureus試驗組蜘蛛體內(nèi)的SOD活性高達(dá)63.15 U/mgprot，幾乎是對照組的3倍；E.coli試驗組蜘蛛體內(nèi)CAT極顯著高于對照組；染菌試驗組蜘蛛的GSH-Px活性變化差異顯著，S.aureus試驗組蜘蛛的GSH-Px活性極顯著降低；而E.coli試驗組蜘蛛GSH-Px活性極顯著增高，幾乎是S.aureus試驗組蜘蛛的2倍；與對照組相比，S.aureus試驗組蜘蛛體內(nèi)MT顯著升高，而MT在E.coli試驗組蜘蛛體內(nèi)無顯著性差異。這表明鎘對染菌蜘蛛體內(nèi)的抗氧化酶活性和解毒物質(zhì)MT的影響表現(xiàn)出顯著差異性。

圖1 鎘對染菌擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)可溶性糖（A）和可溶性蛋白（B）含量的影響

圖2 鎘對染菌擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)抗氧化酶、金屬硫蛋白活性的影響

3 結(jié)論與討論

組織中的可溶性糖和可溶性蛋白是生物體對抗外界環(huán)境脅迫和病理應(yīng)激時的重要能量物質(zhì)，亦是研究生物環(huán)境應(yīng)激的生化指標(biāo)[18-19]。試驗結(jié)果表明，鎘顯著升高了染菌蜘蛛體內(nèi)的可溶性糖含量，而顯著抑制染菌蜘蛛體內(nèi)的可溶性蛋白含量。而且，感染E.coli后，試驗組蜘蛛體內(nèi)的可溶性糖含量明顯低于感染S.aureus后的試驗組蜘蛛。這說明鎘對于染菌蜘蛛體內(nèi)的可溶性糖和可溶性蛋白這2種能量物質(zhì)產(chǎn)生了顯著影響，且這種差異與微生物的種屬相關(guān)。

鎘通過誘導(dǎo)超氧陰離子自由基（O2-·）、羥基自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）等活性氧的增加，增強(qiáng)膜脂質(zhì)過氧化程度，阻礙線粒體呼吸調(diào)節(jié)功能和氧化磷酸化偶聯(lián)等途徑，從而導(dǎo)致組織氧化損傷[20-21]。鎘污染顯著影響節(jié)肢動物體內(nèi)抗氧化酶系和金屬硫蛋白等生物活性物質(zhì)的活性，且各種活性物質(zhì)的變化受到機(jī)體生理指標(biāo)、種類和性別、金屬暴露途徑等多重因素的協(xié)同影響[22-23]。筆者的試驗結(jié)果證明，重金屬鎘顯著影響了染菌蜘蛛體內(nèi)抗氧化酶活性和MT含量。感染S.aureus和E.coli后試驗組蜘蛛體內(nèi)SOD的活性以及感染E.coli后試驗組蜘蛛體內(nèi)的CAT和GSH-Px活性均顯著提升，而感染S.aureus后試驗組蜘蛛體內(nèi)GSH-Px活性顯著降低。鎘造成的機(jī)體氧化損傷誘導(dǎo)了染菌蜘蛛體內(nèi)CAT和GSH-Px的活性升高。在感染S.aureus后，鎘抑制了蜘蛛體內(nèi)的GSH-Px活性和MT含量，尤其在感染S.aureus后試驗組蜘蛛體內(nèi)的MT含量顯著降低。這表明在病源微生物和鎘毒性的雙重脅迫下，MT因與鎘離子結(jié)合而含量顯著減少，降低了MT的解毒和抗氧化功能。在不同病源微生物脅迫下，鎘導(dǎo)致蜘蛛機(jī)體不同抗氧化酶活性以及MT和能量物質(zhì)的含量變化差異顯著，這可能是蜘蛛機(jī)體選擇性抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果。多重因素相互協(xié)同/拮抗導(dǎo)致污染物對生物機(jī)體產(chǎn)生的毒性影響極其復(fù)雜且差異顯著[24-25]。唐維媛等[26]的研究證明，斜紋夜蛾感染萊氏野村菌后，其體內(nèi)抗氧化酶SOD和CAT活性變化顯著，且與蟲體發(fā)育階段等生理特性有關(guān)。而筆者的研究表明，重金屬鎘顯著影響染菌蜘蛛體內(nèi)的生理生化指標(biāo)和抗氧化酶活性，但是有關(guān)鎘對蜘蛛抗菌免疫功能的影響機(jī)理以及病源微生物與鎘對蜘蛛的協(xié)同毒性與機(jī)理還需進(jìn)一步探究。