QuEChERS/UPLC-MS/MS法測定新鮮蓮子中15種農藥殘留

易 幸

（湘潭市農產品質量安全檢測管理站，湖南 湘潭 411100）

蓮子屬睡蓮科，是水生草本植物蓮的種子[1-2]。湖南湘潭縣的湘蓮、浙江武義縣的宣蓮、福建建寧縣的建蓮和江西廣昌縣的贛蓮為我國四大蓮子，均為中國國家地理標志保護產品。蓮子是藥食同源的中藥，具有健脾止瀉、益腎固精、養心安神[3]、補中益氣[4]、清熱解毒等功效[2]，是老少皆宜的滋補保健佳品[5]。隨著蓮種植的快速規?；l展，蓮藕腐敗病、蓮葉枯病、蓮葉斑病等蓮病蟲害現象也愈來愈嚴重[6]，噴灑農藥已逐漸成為當前防治蓮病蟲草害的主要手段[7]。我國強制性國家標準GB2763—2019[8]中新增了多菌靈、吡蟲啉、嘧菌酯、吡蚜酮、啶蟲脒、丙環唑6種藥劑在蓮子（鮮）中的最大殘留限量值。目前，國內外文獻對蓮子的相關研究主要集中在化學成分分析及其作用方面，而農藥殘留檢測的文獻報道不多。如Miao等[9]建立了QuEChERS提取和氣相色譜-電子捕獲檢測器（GC-ECD）同時測定蓮子中36種有機氯和擬除蟲菊酯類農藥殘留的方法；張新忠等[7]建立了石墨化碳SPE柱凈化，UPLC-MS/MS法同時測定蓮子中12種農藥殘留的方法。筆者擬用QuEChERS提取及超高效液相色譜-串聯質譜法，研究新鮮蓮子中吡蚜酮、甲胺磷、多菌靈、滅多威等15 種農藥殘留的測定方法。該方法可檢測有機磷類、氨基甲酸酯類、苯并咪唑類、煙堿類、甲氧基丙烯酸酯類、吡唑類、吡啶類等多類農藥殘留，且操作簡單、步驟少、耗時短，無需經SPE柱凈化，準確度及精密度都比較理想，適宜于蓮子（鮮）多農殘的測定和分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的新鮮蓮子采自湘潭縣湘蓮種植基地。

主要試劑有乙腈（色譜純，美國賽默飛），甲醇（色譜純，德國默克），甲酸（色譜純，天津光復），乙酸（色譜純，美國天地），乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）凈化劑、十八烷基鍵合相硅膠（C18）凈化劑（天津博納艾杰爾），無水硫酸鎂（優級純，西亞試劑），氯化鈉（分析純，國藥試劑）。農藥標準品包括吡蚜酮、甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧樂果、多菌靈、滅多威、吡蟲啉、啶蟲脒、涕滅威、克百威、嘧菌酯、氟蟲腈、倍硫磷、甲拌磷、辛硫磷，均從農業部環境質量監督檢驗測試中心（天津）購買，以上15種標準品的濃度均為1 000 μg/mL。試驗用水均為超純水。

主要儀器與設備有TSQ Quantum Acess超高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀（配有電噴霧離子源，美國賽默飛公司），電子天平（0.01 g和0.001 g，梅特勒-托利多有限公司），食品加工機（飛利浦），FA25高速分散勻漿機（德國弗魯克公司），H1850高速離心機（湖南湘儀有限公司），Vortex-2渦旋混勻儀（上海滬析實業有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 （1）標準儲備液配置：分別從濃度為1 000 μg/mL的15種標準溶液中，準確吸取0.4 mL至 10.00 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制為40 μg/mL混合標準儲備液，-18℃以下儲存。（2）標準工作液配置：分別用甲醇和空白樣品基質液配制濃度為5、10、50、100、500 μg/L的15種混合標準溶液工作標和基質標。

1.2.2 樣品制備 剝去蓮子外殼，充分混勻，經縮分后，放入食品加工機內打碎，制成待檢樣，置于-18℃以下，備用。

1.2.3 樣品前處理流程 試驗采用QuEChERS法對樣品進行提取凈化，其操作流程如下：準確地稱取20.0 g 制備好的新鮮蓮子樣品于100 mL 離心管內，用量筒量取40.0 mL提取溶劑加入離心管中，高速勻漿1 min，加入4 g氯化鈉，劇烈振蕩1 min，4 000 r/min離心3 min，移取2.0 mL上清液至5 mL離心管中，加入一定量的凈化劑進行吸附凈化，渦旋1 min，12 500 r/min離心3 min，吸取1.0 mL上清液于已加入1.0 mL水的5 mL離心管內，混合均勻后，過0.22 μm尼龍微孔濾膜至2 mL進樣瓶中，待UPLC-MS/MS上機測定。

1.2.4 樣品前處理優化 （1）提取溶劑的選擇：首先比較了丙酮、乙腈、乙酸乙酯、正己烷對15種農藥的提取效果，然后進一步對乙腈與含0.1%乙酸的乙腈的提取效果進行了比較。（2）凈化劑及其用量的確定：常用的凈化劑有PSA、GCB、C18、無水硫酸鎂等，其中PSA凈化劑主要是去除各種有機酸、色素、糖、脂肪酸等[10]，GCB適合去除基質中的色素、甾醇類等雜質，C18用來去除維生素、色素、甾醇效果較好，無水硫酸鎂主要是去除水分?？紤]到蓮子的成分，研究考察了PSA、C18及無水硫酸鎂作為凈化劑對蓮子樣品中藥劑添加回收率和基質溶液顏色的影響，并對其用量進行了探討，詳見表1。

表1 QuEChERS法中不同凈化劑的比例

1.2.5 液相色譜條件優化 （1）色譜柱：比較了Waters XBridge BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）和Thermo ACQUITY C18柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）2種色譜柱的分離效果。（2）流動相：先比較了水-甲醇體系與0.1%甲酸水溶液-甲醇體系作為流動相時目標農藥的色譜峰形及分離效果，再進一步比較了0.1%甲酸水溶液-乙腈與0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相時對目標農藥色譜峰峰形及響應值的影響。（3）洗脫方式：考察了0.1%甲酸水溶液-甲醇體系作為流動相不同比例等度洗脫和梯度洗脫時，目標農藥的分離效果、靈敏度、重復性和保留時間等的影響。

1.2.6 質譜條件優化 將一定濃度的甲醇標準溶液，通過蠕動泵直接進入質譜儀中，在ESI正離子或負離子模式化合物經過電噴霧離子源形成穩定離子，通過全掃描MS模式準確確定母離子，優化錐孔電壓，使母離子的豐度達到最大。再用子離子掃描MS/MS 模式，選擇相對豐度較高、出峰穩定的碎片離子作為子離子。最后在選擇反應監測SRM模式下，進一步優化錐孔電壓和碰撞能量，使子離子的豐度最高，從而得到質譜參數[11]。

1.2.7 基質效應弱化 （1）基質效應基本定義及計算方法?；|效應是指待測物中除目標物外的其他物質對其測定結果的本質影響[12-13]。在質譜分析中，基質效應產生的主要原因是在離子化過程中，基質各組分與目標物之間相互競爭，分為基質增強和基質抑制效應[14]?；|效應通常用相對響應值法進行評估，公式為ME（%）=（A/B）×100，其中，ME是基質效應，A是基質標準工作液的響應平均值，B為甲醇溶劑的同濃度標準工作液的響應平均值。（2）基質效應評價。當ME為80%～120%時，為弱基質效應；當ME為50%～80%或120%～150%時，為中等基質效應；當ME≤50%或≤150%時，為強基質效應[15]。當ME＜100%為基質抑制效應，ME＞100%為基質增強效應。常用的消除或減弱基質效應的方法為基質匹配標樣校正法、內標法、稀釋法和統計學校正法等[13]。該研究采用空白基質提取液匹配標準溶液校正法對基質效應進行弱化，通過外標法進行定量分析。

1.2.8 方法驗證 將空白樣品基質提取液配制的各濃度混合標準溶液上機檢測，以濃度為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線，考察15種農藥的濃度與峰面積的線性關系和定量限。在空白蓮子樣品中添加不同濃度目標物進行添加回收率試驗，相同添加濃度進行7 次重復測試，以驗證方法的回收率及精密度。

2 結果與分析

2.1 樣品提取最佳條件

2.1.1 最佳提取溶劑 常用的提取溶劑有丙酮、乙腈、乙酸乙酯、正己烷，極性強弱順序為乙腈＞丙酮＞乙酸乙酯＞正己烷。試驗結果顯示，在0.1 mg/kg的農藥添加濃度水平時，乙腈提取效果較理想，丙酮提取效果次之，乙酸乙酯和正己烷的提取效果最差。這可能是因為乙酸乙酯和正己烷的極性較弱，而有機磷和氨基甲酸酯類農藥的極性較大，根據相似相溶原理，乙酸乙酯和正己烷的提取效果不理想；丙酮的極性較強，雖能溶解大部分農藥，卻也能溶解植物組織中的油脂和色素，不利于接下來的凈化；乙腈的極性較強，對有機磷和氨基甲酸酯類等強極性農藥的溶解性更好，加上乙腈對油脂、色素等雜質的溶解少，同時還可有效減少淀粉和蛋白質向提取液遷移。故選擇乙腈進行后續試驗。進一步對乙腈與含0.1%乙酸的乙腈的提取效果進行了比較，結果顯示，這2種提取溶劑對大多數目標農藥的提取效果差不多，但甲胺磷、氧樂果等目標農藥在添加了0.1%乙酸的乙腈中提取效率有所提高，可能是乙腈中加入少量乙酸后，溶液為弱酸體系，有利于保持大部分農藥的穩定性，因為有機磷類農藥和氨基甲酸酯類農藥是酯類結構，堿性環境促使其加速水解，相反在弱酸環境下則水解得較慢，故蓮子樣品的最終提取溶劑確定為含0.1%乙酸的乙腈溶液。

2.1.2 最佳凈化劑及用量 試驗結果顯示，在添加了0.1 mg/kg農藥的蓮子樣品中，不同用量的PSA、C18、無水硫酸鎂對提取液的顏色影響不大，可能是因為蓮子的提取液本身顏色較淺。由表1可知，當無水硫酸鎂的用量從0.100 g/mL增加至0.150 g/mL時，目標物的回收率相差不大，可能是蓮子樣品的含水量本身較低。當PSA的用量從0增加至0.025 g/mL時，回收率明顯提高；但當PSA的用量從0.025 g/mL增加至0.050 g/mL時，部分目標農藥的回收率略有下降。當添加PSA用量不變，C18的用量從0增加至0.025 g/mL時，回收率變化不明顯，而C18的用量從0.025 g/mL增加至0.050 g/mL時，部分目標農藥的回收率略有下降。這表明過量使用PSA、C18和無水硫酸鎂，會吸附目標物，導致目標物回收率偏低。而適量的PSA不僅能有效去除蓮子中的色素和糖類，還能達到較高的回收率，同時在添加了PSA的條件下，適量C18對湘蓮回收率及凈化效果并無多大影響，且因湘蓮本身含水量低，減少無水硫酸鎂的用量不會對回收率產生影響，同時還可避免因過多的無水硫酸鎂放熱，導致溫度升高過快，影響遇熱易分解農藥的提取效果[16]。綜合考慮，最終選擇以0.025 g/mL PSA+0.100 g/mL 無水硫酸鎂混合物作為凈化劑，添加回收率達到86.8%～108.8%。

2.2 色譜條件參數

2.2.1 色譜柱 試驗結果表明，在同一色譜和質譜條件下，15種目標物在色譜柱Waters XBridge BEH C18上，保留性能更好，保留時間和色譜峰型都較理想。

2.2.2 流動相 試驗結果顯示，0.1%甲酸水-甲醇體系色譜峰響應更強，峰形更好，靈敏度更高，因為加入甲酸后，更好地提高了目標農藥的離子化效率。進一步比較0.1%甲酸水溶液-乙腈與0.1%甲酸水溶液-甲醇2種流動相對目標農藥色譜峰峰形及響應值的影響，結果顯示，目標物色譜峰的保留時間、響應值等都受流動相影響。這2種體系作流動相時，目標農藥的峰形均較尖銳，且能很好地分離，然而采用0.1%甲酸水溶液-乙腈體系作流動相時，目標物保留時間比0.1%甲酸水溶液-甲醇作流動相時要短些，但大多數目標物峰的響應值卻比0.1%甲酸水溶液-甲醇體系作流動相時低至少一倍以上，原因可能是在甲醇體系中，目標物的離子化效率相對更高。綜合考慮到目標物的色譜峰形、保留時間、響應值、分離度、靈敏度和信噪比等因素，選擇0.1%甲酸水溶液-甲醇體系作為流動相，目標農藥的色譜峰形和分離效果均較理想，響應值更高。

2.2.3 洗脫方式 試驗結果顯示，采用等度洗脫方式時，目標物的分離效果、靈敏度、重復性和保留時間均不理想；而進行梯度洗脫時，目標農藥色譜峰的保留時間短，峰寬變窄，峰形尖銳，靈敏度高。

因此，綜合考慮最終確定色譜柱為Waters XBridge BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm），柱溫40℃；以0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）作為流動相，進行梯度洗脫，梯度洗脫程序見表2，流速0.3 mL/min；進樣體積2 μL。

表2 流動相梯度洗脫程序

2.3 質譜條件參數

優化后，質譜條件為：電噴霧離子源（ESI）；正、負離子掃描模式；噴霧電壓（+）3.5 kV、（-）2.5 kV；離子傳輸管溫度350℃；離子源溫度300℃；鞘氣壓力0.20 MPa；輔助氣壓力0.069 MPa；碰撞氣為Ar氣，壓力0.199 5 Pa。采用選擇反應監測掃描（SRM），以目標化合物的保留時間和離子對信息進行定性分析，以其定量離子峰面積進行定量分析，15種農藥的具體質譜參數見表3。

2.4 基質效應

由表4可知，優化后，吡蚜酮存在強基質效應，甲胺磷、氧樂果、多菌靈、甲拌磷4種農藥存在中等基質抑制效應，其余農藥存在弱基質抑制效應。

表3 SRM監測模式下15種農藥的質譜參數

2.5 方法的線性方程、定量限、回收率及精密度

表4 15種農藥在蓮子中的基質效應 （%）

如表5所示，各目標物基質匹配標準溶液的濃度與其峰面積的線性關系良好，相關系數（R2）均大于0.99，方法的定量限為5.00～10.0 μg/kg；添加回收試驗結果顯示，在低、中、高3個添加水平下，平均添加回收率在82.5%～108.8%之間，相對標準偏差（RSD）在2.1%～8.6%之間，均滿足“GB/T 27417—2017合格評定化學分析方法確認和驗證指南”以及農業部2386號公告《農藥殘留檢測方法國家標準編制指南》的要求。15種農藥的SRM色譜圖見圖1。

2.6 實際樣品測定

應用該研究優化后的提取測定方法對采自湘潭縣蓮子生產基地的20份湘蓮樣品進行15 種農藥殘留的檢測，檢測結果為15種農藥均未檢出。

3 結 論

應用QuEChERS提取及超高效液相色譜-串聯質譜法，建立了新鮮蓮子中吡蚜酮、甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧樂果、多菌靈、滅多威、吡蟲啉、啶蟲脒、涕滅威、克百威、嘧菌酯、氟蟲腈、甲拌磷、倍硫磷、辛硫磷15種農藥殘留的檢測分析方法，涉及有機磷類、氨基甲酸酯類、苯并咪唑類、煙堿類、甲氧基丙烯酸酯類、吡唑類、吡啶類等多種農藥類型。

表5 目標化合物的線性回歸方程、添加回收率和精密度結果

試驗結果表明：新鮮蓮子樣品用含0.1%乙酸的乙腈提取，用0.025 g/mL PSA+0.100 g/mL無水硫酸鎂混合物凈化，回收率和凈化效果最優；采用優化后的色譜和質譜條件對樣品中吡蚜酮、甲胺磷、乙酰甲胺磷等15種農藥進行檢測，在5～500 μg/L質量濃度范圍內，15種農藥的質量濃度與其峰面積的線性關系良好，線性回歸系數（R2）均大于0.99，方法的定量限為5.00～10.0 μg/kg；在低、中、高3個添加水平下，平均添加回收率在82.5%～108.8%之間，相對標準偏差（RSD）在2.1%～8.6%之間。該方法前處理操作簡單，步驟少，耗時短，無需經SPE柱等凈化，且準確度及精密度都比較理想，能滿足對新鮮蓮子中15種農藥殘留的定性定量分析要求，適宜于蓮子（鮮）農藥殘留的測定和分析。

應用該研究優化后的提取測定方法對采自湘潭縣蓮子生產基地的20份湘蓮樣品進行15 種農藥殘留的檢測，檢測結果為15種農藥均未檢出，表明該基地所產蓮子的農藥殘留量均符合“藥用植物及制劑進出口綠色行業標準”和“GB2763—2019食品中農藥最大殘留限量”的相關要求。

圖1 15種農藥的SRM色譜圖