土壤強還原處理對植煙土壤真菌群落結構及烤煙產質量的影響

魏光鈺，胡 勇，吳永琴，張清壯，李 鑫

（1. 貴陽市煙草公司清鎮市分公司，貴州 清鎮 551400；2. 湖南省農業科學院，湖南 長沙 410125）

烤煙產業健康可持續發展與植煙土壤質量以及土壤微生態環境息息相關。土壤微生物主要參與植物養分的循環利用、土壤結構的維持以及農用化學品的降解等過程[1]。有研究表明，土壤中微生物的組成與功能決定了植物的生存狀況[2]以及發病率[3]。健康的微生態系統對作物生長至關重要。土壤微生物組成單一以及病原菌富集是土壤連作障礙的主要成因[4-5]。烤煙連續種植以及化肥的大量施用，往往導致植煙土壤質量劣變[6]、有害微生物數量增加[7]、烤煙產量下降[8]等問題。因此，研究安全有效的土壤消毒技術是保障烤煙產業健康可持續發展的有利舉措。

土壤強還原處理（RSD）是通過向土壤中添加易降解的有機物，灌水、覆膜，在短時間內形成厭氧、強還原以及高溫的環境，產生揮發性氣體、有機酸等各類物質，有效殺滅病原菌，重新組建微生物群落的方法[9]。王寶英等[10]通過向土壤中添加有機物料，淹水覆膜處理后能明顯著增加芥藍產量，降低根腫病的發病率。伍朝榮等[11]發現通過土壤強還原處理可顯著改變番茄連作土壤中細菌群落的結構組成及多樣性，有效降低土壤中青枯菌數量。Strauss等[12]將當地農作物秸稈作為有機物料添加到土壤中，當添加量達到20.2 t/hm2即可形成病原菌致死致命環境。而Wen等[13]研究發現，當秸稈添加量為3、1.5 t/hm2時均能有效抑制尖刀鐮刀菌生長。由此可見，在RSD處理過程中，有機物料的添加量以及處理后微生物群落的變化與處理效果息息相關。已有RSD法用于芥藍[10]、三七[14]等不宜連作作物的研究報道，然而大部分研究聚焦在有機物料種類選擇和用量確定2個方面，并且試驗往往以大棚或盆栽的形式開展，而關于RSD處理在實際種植生產中應用的研究報道較少。

筆者聚焦引起煙草土傳病害相關的的真菌群落結構，利用RSD技術，探索有機物料不同添加量對菌群多樣性、結構及烤煙產量的影響，以期為RSD技術的推廣利用、健康煙田土壤微環境的重組以及煙葉優質生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗田位于貴州省清鎮市紅楓湖鎮駱家橋村烤煙種植基地，該地區屬于北亞熱帶季風濕潤氣候，年平均氣溫14.1℃，年降雨量1 180.9 mm，無霜期283 d。該試驗田已連續5 a種植烤煙。試驗前0～20 cm土層的基本理化性質為：有機質36.23 g/kg，全氮2.00 g/kg，堿解氮135.31 mg/kg，有效磷32.50 mg/kg，速效鉀428.74 mg/kg，pH值6.62。供試有機物料為甘蔗渣，總有機碳（TOC）含量為45.6%，全氮（TN）含量為1.12%，C/N=40.7。

1.2 試驗設計

田間試驗共設置3個處理，分別為：CK，不做任何土壤處理的對照；T1，甘蔗渣添加量為9 t/hm2的RSD處理；T2，甘蔗渣添加量為13.5 t/hm2的RSD處理。每個處理設置3個重復，共9個小區，每小區面積為36 m2。各小區之間以40 cm深、30 cm寬的溝渠隔開。RSD處理的具體步驟如下：煙田平整后，將甘蔗渣均勻撒在土壤表面，通過旋耕機將其與耕作層土壤混合均勻并充分灌溉，用塑料膜覆蓋處理30 d，處理期間土壤溫度為20～30℃。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 土壤樣品采集 待RSD處理結束后，揭開塑料薄膜，采集土壤樣品。各小區按“S”型五點取樣法，每個小區取≥1.5 kg的土樣，過2 mm篩。過篩后的土壤樣品分成2份：一份自然風干后用于土壤主要理化性質測定，另一份保存在-80℃，用于土壤真菌多樣性測定。

1.3.2 土壤理化性質測定 測定指標包括pH值、有機質（SOM）、全氮（TN）、堿解氮（AN）、有效磷（AP）、速效鉀（AK），具體方法參見鮑士旦[15]編著的《土壤農化分析》。

1.3.3 群落結構檢測 采用高通量測序法檢測土壤真菌多樣性和群落結構：用DNA試劑盒（FastDNA?Spin Kit）提取土壤樣本中的DNA，用瓊脂糖凝膠電泳對所提取的DNA進行濃度和純度檢測；經PCR擴增純化后，將純化后的擴增子根據97%的相似度對序列進行OTU（Operational taxonomic unit）聚類，生成OTU表格[16]。具體試驗過程由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.3.4 烤煙產量統計 煙葉烘烤后，分別統計各處理的上等煙比例、均價、產量、產值，并折算成單位面積煙葉產量、產值。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2007軟件進行數據分析，用R語言計算相關性，采用Origin 9.1及TBtools[17]作圖，并采用SPSS 25軟件中單因素方差分析（oneway ANOVA）和Duncan新復極差法進行多重比較（α=0.05）。

2 結果與分析

2.1 RSD處理對土壤理化性質的影響

由表1可知，與CK處理相比，施用甘蔗渣的RSD處理可明顯提高土壤pH值，但是不同施用量對土壤pH值的提升效果不一致，其中T2處理土壤pH提升最大，由6.617提升至7.128，較CK處理增加了7.72%。與對照相比，RSD處理后的土壤有機質（SOM）、全氮（TN）、堿解氮（AN）的含量顯著增加，并且土壤中有機質、全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀的含量隨甘蔗渣施用量的增加而增加，其中T1處理土壤中有機質、全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀的含量較CK處理分別增加了24.48%、11.96%、7.66%、32.01%、24.14%；T2處理土壤中有機質、全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀的含量較CK處理分別增加了36.18%、19.77%、21.93%、80.28%、58.63%。

表1 各處理的土壤理化性質

2.2 RSD處理對土壤真菌多樣性的影響

3個處理共9個土壤樣品經高通量測序后得到508 476個序列，在相似度97%的水平下聚類后共得到1 053個OTU。所有處理的真菌稀疏曲線都趨向于接近飽和平滑（圖1B），說明測序reads的數據量是足夠的。各處理間OTU的重疊情況用Venn圖顯示，由圖1A可知，3個處理間共有的OTU數量為110個，而特有的OTU數目以T2處理最多。

圖1 RSD處理對土壤真菌多樣性的影響

經過30 d的RSD處理后，土壤中真菌群落的豐富度指數（Chao1、ACE）和多樣性指數（Simpson、Shannon）如表2所示。與CK處理相比，T1、T2處理的Simpson指數有所降低，而Chao1、ACE豐富度指數明顯升高，且各處理間差異顯著。這表明RSD處理可改變土壤真菌群落的豐富度和多樣性，且隨著甘蔗渣施用量的增加，土壤真菌群落豐富度和多樣性隨之提高。當甘蔗渣施用量為13.5 t/hm2時，土壤中真菌群落多樣性變化最大。

表2 RSD處理對土壤真菌多樣性指數的影響

2.3 RSD處理對土壤真菌群落組成的影響

采用Principal coordinate analysis（PCA）從物種分類中門的角度分析了不同處理土壤中的真菌群落結構，結果如圖2所示。PCA分析第一軸解釋度為45.61%，第二軸解釋度為32%；在門水平上，3組處理土壤樣品中真菌群落具有顯著差異；其中，CK處理與T1、T2處理間的距離較遠，表明CK處理與RSD處理之間的微生物群落結構相似度很低；而T1和T2之間距離也較遠，表明RSD處理時甘蔗渣施用量對土壤真菌群落結構也有明顯的影響。

圖2 不同處理間土壤真菌群落在門水平的主坐標分析

由圖3A可知，各處理土壤中真菌主要由子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、油壺菌門（Olpidiomycota）、毛霉菌門（Mucoromycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）等17個真菌門組成。其中，子囊菌門、擔子菌門、油壺菌門和壺菌門是對照土壤中的優勢菌門；經RSD處理后，土壤中子囊菌門的豐度顯著增加，擔子菌門、油壺菌門和羅茲菌門的相對豐度則明顯降低。由圖3B可知，土壤中真菌屬主要由木霉屬（Trichoderma）、毀絲霉屬（Myceliophthora）、擬青霉屬（Simplicillium）、黑孢殼屬（Melanospora）、帚霉屬（Scopulariopsis）等19個真菌屬組成，其中優勢菌屬是木霉屬、毀絲霉屬、擬青霉屬、黑孢殼屬。與CK處理相比，油壺菌屬（Olpidium）的相對豐度在T1、T2處理中顯著降低，而木霉屬的相對豐度在T1、T2處理中顯著增加，毀絲霉屬的相對豐度則在T2處理中顯著增加。

2.4 RSD處理后土壤中變化顯著的真菌屬

由圖4可知，經RSD處理后，土壤中炭黑粉菌（Anthracoidea）的相對豐度顯著減少，由CK處理的2.21%減少到T2處理的0.17%；油壺菌屬（Olpidium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、鏈格孢屬（Alternaria）的相對豐度經過土壤強還原處理后顯著降低，其中油壺菌屬從對照處理的10.97%下降到T2處理的0.48%，減少了95.62%；鐮刀菌屬和鏈格孢屬則未在T2處理中發現。與CK相比，RSD處理能顯著增加土壤中端梗孢屬（Acrophialophora）和毀絲霉屬（Myceliophthora）的相對豐度，并且隨著甘蔗渣施用量的增加，土壤中這2種真菌屬的相對豐度增加。與CK相比，木霉屬的相對豐度顯著增加，由CK的0.16%增加到T1的20.13%、T2的18.63%，分別增加了124.8、115.4倍。這說明RSD處理能顯著改變土壤中部分真菌屬的相對豐度。

圖3 RSD處理土壤真菌門（A）、屬（B）水平的相對豐度

圖4 RSD處理后土壤中變化顯著真菌屬的相對豐度

2.5 土壤理化性質與真菌群落的關聯分析

對土壤理化性質指標和真菌屬相對豐度利用R計算進行spearman相關性分析，結果通過FDR（false discovery rate）校正，采用TBtools軟件獲得相關性熱圖。由圖5可知，土壤中炭黑粉菌屬（Anthracoidea）、鐮刀菌屬（Fusarium）、鏈格孢屬（Alternaria）、油壺菌屬（Olpidium）與部分土壤理化性質指標呈顯著或極顯著負相關性，其中炭黑粉菌屬與土壤有機質、有效磷極顯著負相關，與速效鉀顯著負相關；鐮孢屬與土壤有效磷、速效鉀顯著負相關；鏈格孢屬則與土壤速效鉀極顯著負相關，與全氮、堿解氮、有效磷顯著負相關；油壺菌屬僅與土壤有機質顯著負相關。此外，毀絲霉屬（Myceliophthora）與土壤有效磷、速效鉀極顯著正相關，與全氮顯著正相關；柄孢殼屬（Zopfiella）與土壤pH值、有效磷顯著正相關。

2.6 RSD處理對烤煙經濟性狀的影響

經RSD處理后，煙葉的經濟性狀如表3所示，與CK相比，RSD處理能顯著增加烤煙的產量和產值，提升上等煙比例；上等煙比例表現為T2＞T1＞CK。對比T1、T2處理可知，甘蔗渣的添加量會影響烤煙的經濟性狀，隨著甘蔗渣施用量的增加，烤煙產值和上等煙比例增加。T2處理的產量較CK提高了8.18%，較T1提高了2.97%；T2處理的烤煙產值較CK提高了13.90%，較T1提高了5.42%。由此可知，RSD處理可提高烤煙的產量和產值，且效果隨著甘蔗渣施用量的增加而增強。

表3 不同處理烤煙的經濟性狀

圖5 土壤真菌屬與理化性質的相關性熱圖

3 結論與討論

通過將甘蔗渣與土壤混合，灌水、覆膜處理30 d后，土壤pH值由CK處理的6.617提升至T2處理的7.128，且對pH值的提升效果隨著甘蔗渣的添加量增加而增強，這一現象與Zhao等[18]的研究結果基本一致。土壤有機質含量與甘蔗渣的施用量直接相關，這可能是由于甘蔗渣未完全分解，產生的小分子有機物成為土壤有機質的一部分，從而提高了土壤有機質含量[19]。RSD處理還可以顯著提高土壤中全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀的含量。這些養分含量的升高對于改善土壤理化性質、提高煙草產量以及改善煙葉品質有一定促進作用[20]。

添加有機質對土壤進行厭氧處理可明顯改變土壤微生物群落結構[21-22]。試驗結果顯示，RSD處理后，土壤中真菌Simpson多樣性指數減小，Chao1、ACE豐富度指數顯著增加，表明經過RSD處理，土壤真菌群落的豐富度以及多樣性增加，Huang等[16]的也發現了這一現象。經RSD處理后，土壤中子囊菌門的相對豐度顯著增加，擔子菌門、油壺菌門和羅茲菌門的相對豐度顯著降低。這可能是因為在厭氧、強還原性、高溫環境中，甘蔗渣分解產生的揮發性氣體、有機酸、低價重金屬等各類有毒物質，在殺滅病原微生物的同時改變了土壤微生物群落結構[23]。T2處理土壤中毀絲霉屬相對豐度顯著增加，這是因為RSD處理使土壤環境溫度升高，而毀絲霉屬在高溫環境中表現出獨特的生存適應能力，能夠通過分泌多種酶（纖維素酶、漆酶、木聚糖酶、果膠酶、脂肪酶、植酸酶和其他雜酶）降解有機物中幾乎所有種類多糖而大量繁殖[24]。作為一種從土壤分離的最常見有益真菌，木霉屬真菌能產生許多具有生物活性的物質（包括細胞壁降解酶和次生代謝產物），用以抑制多種植物病原菌的生長[25]。試驗結果顯示，RSD處理可以顯著增加木霉屬真菌的相對豐度，這對于維護健康微生態環境具有重要意義。此外，土壤中引起煙草赤霉病的鐮刀菌屬、引起赤星病的鏈格孢屬以及作為病毒介體的油壺菌屬的相對豐度均顯著降低，表明RSD技術能有效殺滅土壤中病原菌。這是由于在RSD處理過程中，有機物厭氧分解產生對病原菌有毒有害的物質，如乙酸、丙酸、氨、硫化氫、低價金屬離子等。以上結果表明，有益微生物增加和RSD處理造成的環境因素改變均能降低病原菌的豐度[26]。

此外，Liu[27]的研究表明，環境因素是重組細菌群落的決定因素。土壤中添加甘蔗渣后，理化性質以及真菌群落結構顯著異于對照處理，并且油壺菌屬、鐮刀菌屬、鏈格孢屬與部分理化性質指標顯著負相關，毀絲霉屬與部分理化性質指標顯著正相關。這說明在連作植煙土壤中添加甘蔗渣，能夠重新組建真菌群落，降低病原菌豐度，增加拮抗菌豐度，保證煙草健康生產[28-29]。此外，對各處理烤煙的產量、產值和上等煙比例進行分析發現，RSD處理能提升烤煙的產量、產值及上等煙比例，并且T2處理烤煙的產量、產值及上等煙比例均高于其他2個處理。這說明RSD處理后有助于改善煙葉質量，同時提升烤煙的經濟效益，且效果隨著甘蔗渣施用量的增加而增強。

綜上所述，對連作植煙土壤進行RSD處理，不同的有機物施用量對植煙土壤理化性質以及真菌群落結構的影響隨著有機物施用量的增加而增強，高有機物施用量對土壤中病原菌的滅菌效果更好。這主要是因為施用量越多對環境因素的影響越大，導致土壤真菌群落改變，促進烤煙產質量的提升。但是，有機物料施用量對微生物群落以及烤煙生長是否存在閾值，還有待進一步驗證。