mTOR、Beclin1和LC3在非黑色素瘤性皮膚腫瘤中的表達(dá)

魏姍姍 嚴(yán)卿文 閆璐 邱賢文 賴寬 肖莎 米向斌

(南方醫(yī)科大學(xué) 1珠江醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 510280;2陽春市婦幼保健院皮膚科；3南方醫(yī)院皮膚科；4珠江醫(yī)院病理科)

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(SCC)、基底細(xì)胞癌(BCC)和脂溢性角化(SK)統(tǒng)稱為非黑色素瘤性皮膚腫瘤(NMSC)，是起源于表皮或皮膚附屬器的腫瘤〔1〕，發(fā)展速度較緩慢，絕大部分僅出現(xiàn)局部破壞性病變。SCC和BCC的治療方法多樣，包括手術(shù)、物理、藥物和放射治療等，但仍有一定的局限性，比如復(fù)發(fā)率、手術(shù)切除后形成的瘢痕或畸形影響美觀〔2〕。SK是臨床最常見的皮膚良性腫瘤，病因不明，與紫外線照射及日光性損傷密切相關(guān)。SCC、BCC和SK三者均好發(fā)于中老年人，病理均表現(xiàn)為上皮細(xì)胞增生異常。皮膚腫瘤的形成機(jī)制與其他腫瘤類似，可能與腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、血管生成及細(xì)胞黏附等密切相關(guān)。隨著人口老齡化和檢測手段的進(jìn)展，全球NMSC的發(fā)病率每年增加3%～8%〔3〕，針對其發(fā)病機(jī)制的研究變得尤為重要。

自噬是真核生物特有的溶酶體介導(dǎo)的分解代謝過程，分為巨自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬和微自噬三種。目前巨自噬研究較清楚，也是本文重點(diǎn)研究的對象，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路、c-Jun氨基末端激酶(JNK)/B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)/Beclin1通路、三磷酸肌醇(IP3)和細(xì)胞內(nèi)Ca2+都可以調(diào)控巨自噬的活性〔4〕。Ki-67是一種核蛋白質(zhì)，由Mki-67基因編碼，是細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志物，常可作為預(yù)測惡性腫瘤發(fā)展及預(yù)后的指標(biāo)。自噬與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有望成為腫瘤治療的新方向。然而自噬在皮膚腫瘤中的研究較少，本文擬初步探討mTOR、Beclin1和微管相關(guān)蛋白輕鏈(LC)3在NMSC中的表達(dá)及意義。

1 材料及方法

1.1一般資料 SK組、BCC組和SCC組標(biāo)本各27例，來自2017年1月至2019年1月在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院和南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院就診的患者，病例均行蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組化確診，臨床及病理資料完整。正常對照(Normal)組15例，取自皮膚科活檢手術(shù)切除的部分正常皮膚。各組年齡及性別分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組年齡和性別分布比較

1.2主要試劑 兔源mTOR、LC3、Beclin1抗體均購自美國 Abcam公司。免疫組化試劑盒〔封閉液、二抗及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑〕 購自武漢博士德生物有限公司。

1.3免疫組化及結(jié)果判定 SK、BCC、SCC組織白片來自醫(yī)院病理科，正常皮膚組織石蠟包埋后行4 μm連續(xù)切片。全部切片常規(guī)脫蠟入水，修復(fù)抗原，3%H2O2除去內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉，4 ℃孵育一抗(mTOR、Beclin1、LC3)過夜。第2天依次室溫孵育二抗、DAB顯色，蘇木素復(fù)染，最后脫水透明后烘干封片。由至少兩名病理科診斷醫(yī)師對免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行評估。在顯微鏡下觀察SCC、BCC和SK細(xì)胞和正常表皮著色情況，積分?jǐn)?shù)=陽性染色細(xì)胞百分比評分×染色強(qiáng)度評分。陽性染色細(xì)胞百分比判定標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)標(biāo)本都隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(×200)，每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出每個(gè)視野中陽性細(xì)胞比的平均數(shù)。<5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。染色強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn)：無著色或呈與背景均勻一致的淡黃色為0分；淺棕黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。陽性等級：0分為陰性(-)；1～4分為弱陽性(+)；5～8分為陽性(++)；9～12為強(qiáng)陽性(+++)。

Ki-67免疫組化由兩位病理科醫(yī)師單獨(dú)判讀后取平均。Ki-67陽性標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒染色。先在5倍鏡下隨機(jī)選取病損區(qū)域結(jié)構(gòu)良好、背景清晰的5個(gè)區(qū)域，隨后隨機(jī)觀察5個(gè)200倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出陽性細(xì)胞的所占比例即為Ki-67的百分比。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0和GraphPad Prim 7.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組mTOR的表達(dá) mTOR在SK、BCC和SCC組中的表達(dá)均高于Normal組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；mTOR在SCC組中的表達(dá)顯著高于BCC組(P<0.05)；mTOR在BCC組中的表達(dá)顯著高于SK組(P<0.05)。見表2。mTOR在正常皮膚標(biāo)本中絕大多數(shù)呈弱陽性表達(dá)(圖1)。

圖1 各組中mTOR的表達(dá)

2.2各組Beclin1的表達(dá) 自噬相關(guān)基因Beclin1在正常皮膚標(biāo)本中絕大多數(shù)呈陽性或強(qiáng)陽性表達(dá)(圖2)。Beclin1在BCC和SCC組中表達(dá)均顯著低于Normal組(P<0.05)，在SK組中的表達(dá)低于Normal組，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Beclin1在SK組中的表達(dá)顯著高于BCC組(P<0.05)；Beclin1在BCC組中的表達(dá)顯著高于SCC組(P<0.05)。見表2。

圖2 各組中Beclin1的表達(dá)

2.3各組中LC3的表達(dá) LC3在正常皮膚標(biāo)本中絕大多數(shù)呈陽性或強(qiáng)陽性表達(dá)(圖3)。LC3在SK、BCC和SCC組中表達(dá)均顯著低于Normal組(P<0.05)；LC3在SK組中的表達(dá)顯著高于BCC組(P<0.05) ；LC3在BCC組中的表達(dá)顯著高于SCC組(P<0.05)。見表2。

圖3 各組中LC3的表達(dá)

表2 各組mTOR、Beclin1、LC3的相對表達(dá)比較

2.4各指標(biāo)間相關(guān)性分析 mTOR相對表達(dá)值與Beclin1、LC3表達(dá)值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.486、-0.381，均P<0.01)，Beclin1相對表達(dá)值與LC3呈正相關(guān)(r=0.884,P<0.01)。

2.5Ki-67在BCC和SCC中的百分率 Ki-67在BCC、SCC組中陽性表達(dá)率分別為27.00%±12%、37.48%±10%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

自噬是一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)成分降解過程，具有維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的重要作用。在不同的疾病狀態(tài)下，細(xì)胞自噬具有不同的作用，比如清除損傷作用的細(xì)胞因子、直接誘導(dǎo)損傷細(xì)胞死亡、甚至可能降解正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)〔5〕。自噬相關(guān)基因啟動子、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，蛋白激酶等多種因子的激活都可以調(diào)控細(xì)胞自噬的活性。Beclin1是酵母自噬基因Atg6/VPS30的同源基因，在自噬的發(fā)生、發(fā)展過程中有著重要作用。此外，Beclin1是自噬體形成的一個(gè)必需因子，它可介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于自噬而調(diào)控自噬體的形成與成熟。酶母Atg8基因(在哺乳動物中的同系物是LC3)家族蛋白是細(xì)胞自噬形成過程中重要的適配器蛋白，與細(xì)胞自噬過程中的許多關(guān)鍵步驟相關(guān)，比如自噬體的形成、成熟等。

mTOR是細(xì)胞內(nèi)一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于雷帕霉素的作用靶點(diǎn)，是細(xì)胞生長、新陳代謝、衰老的中心控制器。mTOR有mTORC1和mTORC2兩種不同的復(fù)合體。mTORC1可通過磷酸化核糖體S6激酶調(diào)控蛋白質(zhì)的合成，或通過真核起始因子4E結(jié)合蛋白1促進(jìn)轉(zhuǎn)錄而對細(xì)胞生長、新陳代謝等產(chǎn)生影響〔6〕。mTOR信號通路存在于各種細(xì)胞中，參與細(xì)胞生長、增殖和分化調(diào)節(jié)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。既往的研究表明mTORC1通路在基底細(xì)胞癌中高表達(dá)，而且針對mTOR的靶向藥物對進(jìn)展期基底細(xì)胞癌有治療作用〔7,8〕。Zeng等〔9〕研究顯示咖啡酸正丁酯可通過抑制絲氨酸-蘇氨酶激酶(Akt)/mTOR從而引起皮膚癌細(xì)胞株(A431細(xì)胞)的凋亡。此外，Akt/mTOR的抑制劑LY3023414在皮膚癌細(xì)胞株(A431細(xì)胞)的體內(nèi)、體外研究顯示:在皮膚癌中Akt/mTOR通路被異常激活，而LY3023414可以抑制皮膚癌Akt/mTOR的激活和癌細(xì)胞的生長〔10〕。本研究結(jié)果顯示，mTOR在SCC、BCC和SK中表達(dá)均高于正常皮膚組織，與相關(guān)研究〔7～10〕結(jié)論相似。

自噬是維持細(xì)胞存活、分化和生長所必須的溶酶體降解途徑，與多種腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和細(xì)胞生長密切相關(guān)。mTOR通路與巨自噬密切相關(guān)，可通過以下途徑調(diào)控巨自噬的活性：①在營養(yǎng)豐富的條件下，mTOR可通過直接磷酸化和Unc-51樣自噬激酶(ULK)1蛋白去穩(wěn)定化而對ULK1負(fù)性調(diào)節(jié)；②當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)下降時(shí)，mTOR失活，此時(shí)ULK1可磷酸化AMBRA1和芐氯素(BECN)1，進(jìn)而激活VPS34，最終導(dǎo)致來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的自噬體的成熟，啟動自噬；③下降的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)Ⅰ(Ⅰ級PI3K)/Akt可間接失活mTOR而誘發(fā)巨自噬〔11〕；④mTOR通路可通過抑癌基因，比如p53、人第10號染色體缺失的磷酸酶(PTEN)和結(jié)節(jié)硬化(TSC)2等，調(diào)控自噬的活性〔12〕。既往的研究表明，在肝細(xì)胞癌中mTOR通路被異常激活而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和自噬抑制〔13〕。在銀屑病中，不同蛋白相互作用可通過激活mTORC1而抑制自噬的活性從而促進(jìn)銀屑病的發(fā)生和發(fā)展〔14〕。在皮膚癌中關(guān)于自噬機(jī)制的研究鮮為少見。Thongrakard等〔15〕研究表明皮膚癌細(xì)胞株(A431細(xì)胞)的巨自噬活性較正常組下降。本研究發(fā)現(xiàn)SCC、BCC和SK中自噬活性指標(biāo)Beclin 1、LC3表達(dá)下降，mTOR異常增高；且LC3與Beclin 1的表達(dá)呈正相關(guān)，LC3與mTOR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Ki-67是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核抗原，是評價(jià)腫瘤細(xì)胞增殖程度最可靠的指標(biāo)之一。與BCC相比，SCC組織中Ki-67高表達(dá)，提示腫瘤細(xì)胞增殖活躍，侵襲力強(qiáng)，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，與臨床表現(xiàn)一致。在SCC組織中Ki-67和mTOR均高表達(dá)，提示兩者可能共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，且兩者表達(dá)越高可能預(yù)示腫瘤惡性程度更高、侵襲力更強(qiáng)，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，有希望成為判斷SCC預(yù)后的有力指標(biāo)。

綜上所述，NMSC的發(fā)病可能與mTOR/Beclin 1/LC3信號通路密切相關(guān)，而且mTOR與NMSC的惡性程度呈正相關(guān)，同時(shí)自噬與NMSC的惡性程度呈負(fù)相關(guān)性。因此，降低mTOR從而調(diào)控自噬的活性，可能對NMSC發(fā)生、發(fā)展起到重要的作用。