阿托伐他汀對野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓及肺組織白細(xì)胞介素-8表達的影響

馮垚 張洪淞 李愛歆 劉擎

(1佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154000；2佳木斯市中心醫(yī)院)

肺動脈高壓(PAH)是指肺血管阻力進行性增高的一類疾病，嚴(yán)重影響原發(fā)性心肺疾病患者的預(yù)后，最終可導(dǎo)致患者右心衰竭而死亡。近年來有關(guān)PAH發(fā)病機制及治療的研究已成為國內(nèi)外學(xué)術(shù)研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，血管重構(gòu)(VR)和新生、血管和組織間多種炎性因子浸潤所致的炎癥性改變及原位血栓的形成是PAH的主要病理學(xué)改變。其中血管重構(gòu)被認(rèn)為是造成血管病變及循環(huán)功能紊亂的主要病理學(xué)基礎(chǔ)〔1〕。PAH的VR首先是從構(gòu)成血管內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞(EC)功能障礙開始。EC可分泌多種參與調(diào)節(jié)血管收縮及舒張、纖維溶解等過程的生物活性物質(zhì)，故其受損后可出現(xiàn)血管舒縮障礙、肺小動脈管腔縮小、平滑肌細(xì)胞增生、內(nèi)膜增厚等典型的病理學(xué)改變。而PAH過程中血管新生的活躍也是EC凋亡被抑制的一種體現(xiàn)〔2〕。研究顯示，特發(fā)性PAH(IPAH)患者的肺部血管病灶中可檢測到巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞的浸潤，且患者血清中亦可檢測到多種前炎性細(xì)胞因子和炎性標(biāo)志物的表達上調(diào)，包括白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、可溶性P選擇素(sP-Sel)和可溶性細(xì)胞間黏附因子(sICAM)-1等〔3〕。可見炎癥反應(yīng)在PAH的發(fā)生和演進中扮演重要角色，研究PAH的炎癥過程可能成為尋求有效治療該病的新靶點。IL-8是由巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞表達的一種重要的中性粒細(xì)胞趨化因子，其可通過誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞脫顆粒而促使血管EC上調(diào)表達和分泌IL-8，IL-8進而在血管的炎性循環(huán)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。Koch等〔4〕在硫化氫對PAH大鼠血管炎癥作用的研究中發(fā)現(xiàn)，PAH模型組IL-8含量要明顯高于對照組，這表明IL-8在PAH的炎性反應(yīng)中具有一定的作用。野百合堿(MCT)可在肝臟中代謝成為吡咯MCT，后者進而經(jīng)過一系列病理生理過程而使血管內(nèi)皮損傷、平滑肌細(xì)胞增生和肺血管重構(gòu)。由于MCT可轉(zhuǎn)變?yōu)榭墒寡芷琳瞎δ苁軗p的吡咯MCT，故其已被廣泛應(yīng)用以制備經(jīng)典的PAH動物模型〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)，MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織中參與炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的核因子(NF)-κB mRNA表達升高，說明炎癥反應(yīng)在MCT致PAH發(fā)生和發(fā)展中起重要作用〔6〕。

目前臨床上治療PAH的藥物主要包括前列腺素類、磷酸二酯酶抑制劑和內(nèi)皮素受體拮抗劑等，雖然這些藥物可在一定程度上治療PAH和改善心功能，但有關(guān)各類藥物的有效性和安全性還需經(jīng)臨床實踐進一步驗證。作為3-羥基3-甲基戊二酰輔酶(HMG-Co)A還原酶抑制劑，他汀類藥物目前以其獨立于降脂作用之外的多效性作用被廣泛應(yīng)用于臨床，這包括其被用于改善血管內(nèi)皮功能、治療動脈硬化、抑制炎癥反應(yīng)、改善凝血功能和抑制平滑肌細(xì)胞增殖等。臨床研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可加速冠狀動脈手術(shù)患者中性粒細(xì)胞的凋亡，抑制炎癥反應(yīng)，并可改善PAH患者的右心收縮壓升高、6 min步行距離試驗縮短和心輸出量降低〔7〕。在他汀類藥物中，阿托伐他汀屬第3代產(chǎn)品，其臨床效用和抗炎作用明顯強于比辛伐他汀和氟伐他汀。本研究通過MCT構(gòu)建炎癥性PAH大鼠模型，并應(yīng)用阿托伐他汀干預(yù)來研究其對模型大鼠PAH、右心室肥大指數(shù)和血清IL-8含量的影響，初步探討阿托伐他汀治療PAH的作用機制。

1 材料與方法

1.1溶液及藥品配制 ①0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖溶液(pH6.0)：稱取3.0 g枸櫞酸三鈉和0.4 g枸櫞酸，將二者加入1 000 ml雙蒸水中，磁力攪拌使其分溶解。② 蘇木素染液：稱取2.5 g蘇木素加入25 ml無水乙醇中，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙猓环Q取22 g硫酸鋁鉀加入到500 ml雙蒸水中，加熱使其充分溶解；將蘇木素-乙醇溶液加入硫酸鋁鉀溶液中，并盡快加熱至沸騰；迅速移離熱源，攪拌溶液直至溫度降至90℃左右；稱取1.25 g一氧化汞，緩慢加入溶液中，攪拌溶液直至一氧化汞完全溶解；迅速將溶液置于冷水中靜置；次日過濾后密閉儲存?zhèn)溆谩＂?12.5 mg/ml MCT溶液：將MCT加入適量的20%乙醇中，攪拌使其充分溶解；加入一定量生理鹽水至MCT濃度為12.5 mg/ml。④1 mg/ml阿托伐他汀溶液：將20 mg阿托伐他汀用研磨器研碎，并加入20 ml生理鹽水中充分混合溶解，制備成1 mg/ml 阿托伐他汀溶液。

1.2PAH大鼠模型的建立及動物分組 選取體重200～220 g的雄性SD大鼠24只，在恒溫(21±1)℃、明暗交替(12 h/d)和相對濕度為(50±5)%條件下自由攝食水飼養(yǎng)。將實驗動物隨機分為PAH模型組、阿托伐他汀組和對照組各8只。PAH模型組和阿托伐他汀組按60 mg/kg腹部皮下一次性注射MCT溶液，對照組則注射等量的生理鹽水。自腹腔注射之日起，阿托伐他汀組按10 mg/kg灌胃給予阿托伐他汀溶液，PAH模型組和對照組則灌胃給予等量的生理鹽水。各組均每日灌胃1次，持續(xù)3 w。實驗中共2只大鼠死亡，均屬于PAH模型組，分別死于實驗中的第17天和第21天，呼吸困難為大鼠死亡前的主要表現(xiàn)。

1.3記錄各組實驗動物基本情況及生存情況

1.4血流動力學(xué)檢測 按孫波等〔8〕報道的方法進行操作，具體如下：將外徑為1 mm、具有刻度的10 cm長右心軟管預(yù)充肝素鈉，并用三通管與換能器連接備用；用10%的水合氯醛按300 mg/kg對大鼠進行腹腔麻醉注射；待固定麻醉大鼠后，手術(shù)暴露剝離右側(cè)頸外靜脈和頸總靜脈，并進行右心插管；將導(dǎo)管經(jīng)換能器與數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)連接，利用系統(tǒng)軟件測定平均肺動脈壓(MPAP)。

1.5右心室肥厚指數(shù)檢測 用手術(shù)剪沿房室溝將心房和大血管根部剪掉，然后再沿后室壁間溝切下右心室；吸水紙吸取殘留血液后，對右心室游離壁(RV)和左心室+室間隔(LV+S)進行稱重；利用公式計算右心室肥厚指數(shù)(RVHI)，RVHI= RV/(LV+S)。

1.6肺組織蘇木素-伊紅染色及計算肺小動脈管壁厚度占血管外徑的百分比(WT%)和肺動脈管壁面積占血管總面積的百分比(WA%) 切取右肺中葉組織，進行常規(guī)甲醛固定和石蠟包埋；沿右肺門水平橫向行厚度為 5 μm的切片，然后將切片行蘇木素-伊紅(HE)染色；在光鏡下評估肺小動脈病變情況；按Barth等〔9〕報道的方法測算各組實驗肺組織的肺動脈直徑，將直徑為50～150 μm的血管設(shè)定為目標(biāo)血管；不間斷地分別測算10個目標(biāo)血管的血管總面積(TA)、血管腔面積(VA)、管壁厚度(WT)和血管外徑(ED)。分別利用以下公式計算WT%和WA%；WT%=(2×WT/ED)×100%，WA%=(TA-VA)/TA×100%。

1.7血清中IL-8含量的檢測 利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測大鼠血清IL-8含量。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般狀態(tài)與存活情況 對照組及阿托伐他汀組體毛順滑富有光澤，行動靈活、反應(yīng)敏捷，飲食正常，PAH模型組體毛暗淡少光澤，萎靡不振、反應(yīng)遲鈍，飲食量減少。

2.2各組血流動力學(xué)及右心室肥厚指數(shù)、WT%、WA%、IL-8含量 與對照組比較，PAH模型組和阿托伐他汀組MPAP和RVHI、WT%、WA%、IL-8含量均顯著增高(均P<0.05)；與PAH模型組比較，阿托伐他汀組MPAP和RVHI、WT%、WA%、IL-8含量顯著降低(P<0.05)，見表1。

組別nMPAP(mmHg)RVHIWT%WA%IL-8(ng/ml)對照組815.11±0.7124.93±4.6520.82±4.8330.63±4.7613.65±1.13PAH模型組623.61±2.011)32.87±2.11)38.66±5.481)56.18±6.51)61.21±5.421)阿托伐他汀組820.43±1.341)2)26.65±1.71)2)21.43±4.31)2)37.08±3.81)2)29.36±4.451)2)

2.3各組肺小動脈形態(tài)學(xué)改變 對照組肺小動脈的管壁厚度均一，管腔中見有連續(xù)完整的內(nèi)皮細(xì)胞，且僅有少量結(jié)締組織見于血管周圍；PAH模型組肺小動脈可見管壁增厚和管腔縮小，內(nèi)皮細(xì)胞間的連續(xù)性出現(xiàn)斷裂且不完整，有大量的結(jié)締組織見于血管周圍，且管壁可見大量炎性細(xì)胞浸潤；阿托伐他汀組肺小動脈管壁厚度較均一，僅見輕度管壁增厚和管腔縮小。見圖1。

圖1 各組肺小動脈形態(tài)學(xué)改變(×400)

2.4IL-8含量與MPAP、肺小動脈WT%和WA%的相關(guān)性 IL-8含量與MPAP、肺小動脈WT%和WA%呈明顯正相關(guān)(r=0.82、0.87、0.64，均P<0.05)。

3 討 論

即便PAH臨床類型眾多，但各類型病理生理學(xué)的最顯著特點均是血管性炎癥及血管重構(gòu)引起的PAH的進行性惡化，進而導(dǎo)致右心衰竭乃至全心衰竭，甚至死亡。迄今為止，臨床治療PAH的效果不佳，且經(jīng)常出現(xiàn)不同的不良反應(yīng)。多種因素如缺血缺氧、局部微血栓的形成、血管收縮和舒張因子失衡及炎癥等均可引起PAH發(fā)生復(fù)雜性血管病變。本文MCT誘導(dǎo)大鼠PAH模型的成功構(gòu)建與先前的研究成果相符〔10〕，確認(rèn)了MCT可通過作用于肺動脈系統(tǒng)，導(dǎo)致出現(xiàn)肺動脈EC損傷、平滑肌細(xì)胞增殖和肺間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤等病理學(xué)改變，引發(fā)炎癥性PAH。本研究說明阿托伐他汀能在一定程度上降低肺動脈壓力，這與Souza-Costa等〔11〕實驗結(jié)果一致。

研究表明PAH造成肺血管新生及重建，由于血管新生可致血管阻力增大，進而加重組織缺血缺氧，而在缺血缺氧條件下，組織為了代償又會增加血管新生，由此產(chǎn)生血管新生和組織缺血缺氧之間的惡性循環(huán)，進一步加重了肺動脈重構(gòu)和PAH。Simonini等〔12〕研究顯示，當(dāng)抑制PAH大鼠的血管新生后，可減少大鼠的肺動脈重建，其PAH亦有所改善。本研究表明應(yīng)用MCT可導(dǎo)致大鼠發(fā)生肺血管重建；而當(dāng)應(yīng)用阿托伐他汀干預(yù)后肺小動脈WT%和WA%顯著減小，提示阿托伐他汀可抑制血管新生，改善肺血管重構(gòu)。

IL-8是目前發(fā)現(xiàn)的對中性粒細(xì)胞趨化活性最強的細(xì)胞因子。研究證實腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1β等在炎癥反應(yīng)中的作用很大程度上是通過誘導(dǎo)IL-8來介導(dǎo)完成的。MCT造成肺血管內(nèi)皮損傷后各種因子進入血管平滑肌中層，刺激IL-8的分泌和表達〔13〕。IL-8通過刺激平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖而導(dǎo)致中膜肥厚，并出現(xiàn)肺血管重建。PAH和缺血缺氧狀態(tài)可使骨髓中的內(nèi)皮祖細(xì)胞動員出來，并向損傷部位歸巢〔14〕。IL-8可誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞發(fā)生遷移和增殖，促進新生血管形成〔15〕。但因為新生血管滋養(yǎng)管具有易碎性和滲出性，故其可加速平滑肌細(xì)胞增殖，進一步促進肺血管重建，進而使PAH病情加重和惡化。本研究提示IL-8可參與PAH進程，且在肺血管新生及重建中發(fā)揮顯著作用；阿托伐他汀可通過降低IL-8的分泌，即抗炎途徑對PAH起到一定治療作用；通過降低IL-8的表達減輕血管重建、抑制血管新生可能進一步起到延緩PAH的作用，這與陳建英等〔16〕研究結(jié)果一致。

研究表明，在PAH發(fā)展早期和整個治療過程中他汀類藥物可經(jīng)抗炎作用而治療PAH〔17〕。進一步實驗發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀能降低脂多糖誘導(dǎo)的人肺上皮細(xì)胞IL-6等炎癥因子分泌，表明阿托伐他汀可對人肺細(xì)胞發(fā)揮直接抗炎作用，但其機制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可抑制IL-8的分泌來減輕PAH，考慮可能的機制為抑制調(diào)節(jié)免疫炎癥相關(guān)基因的重要轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活和活性亞基P50的釋放，使其與DNA結(jié)合能力降低，減少IL-8的產(chǎn)生和分泌，抑制炎癥反應(yīng)。Farooq等〔18〕發(fā)現(xiàn)他汀類可通過抑制細(xì)胞內(nèi)P38絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)通路來減輕人EC的炎癥反應(yīng)，而P38MAPK可介導(dǎo)人肺血管EC上包括IL-8、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1在內(nèi)的趨化因子和黏附分子的表達。他汀類可下調(diào)MCT誘導(dǎo)PAH大鼠模型的細(xì)胞癌基因c-fos、TNF-α等表達，從而降低對IL-8的誘導(dǎo)作用。

綜上，阿托伐他汀能減輕MCT誘導(dǎo)的肺部炎癥，降低MPAP和抑制右心室肥厚，可降低模型大鼠血清IL-8水平，提示其可能經(jīng)下調(diào)IL-8表達來發(fā)揮抗炎和抑制血管重構(gòu)功能。然而，有關(guān)阿托伐他汀治療PAH是否存在劑量依賴性、具體通過何途徑降低IL-8的表達仍需要深入研究。