重慶市榮昌區中華田園犬蜱種鑒定及序列分析*

陳紹基，李 芳，譚 純，賈紅菓，梅四鵬，周榮瓊

西南大學 動物醫學院， 重慶 榮昌 402460

蜱隸屬節肢動物門Arthropoda， 蛛形綱Arachnida， 蜱螨亞綱Acari， 寄螨總目Parasiti-formes， 蜱目Ixodida， 是動物體表專性吸血的寄生蟲． 蜱大量寄生于動物體表， 可造成宿主貧血、 消瘦甚至死亡． 蜱蟲作為傳播媒介， 將體內攜帶的致病病原體通過叮咬易感動物使其患病， 病原體在體內生長繁殖并且可以長期帶毒， 同時扮演著傳播媒介和貯藏宿主的雙重角色[1-3]， 影響動物機體正常活動． 目前已知與蜱類傳播相關的病原微生物約190種， 多數疾病為人獸共患病， 如森林腦炎、 萊姆病、 腎綜合征出血熱、 立克次體病[4-6]等， 嚴重危害人類健康并且給畜牧業帶來巨大的經濟損失．

線粒體DNA(Mitochondrial DNA， mtDNA)具有獨立的核外遺傳密碼， 結構簡單、 進化速率快， 較少發生重組、 系母系遺傳具有可溯源性的特點， 可作為標記基因使用[7]， 是目前蜱類分子生物學研究中應用最廣泛的基因， 主要有16SrDNA，12SrDNA，COXI和COXII等基因[8]． 線粒體16SrDNA基因序列由于其保守性、 存在的普遍性以及基因序列本身的穩定性， 常作為蜱種間鑒定的遺傳標記． 本研究利用線粒體基因16SrDNA對重慶市榮昌區中華田園犬蜱進行種屬鑒定及系統發育進化分析， 以期為明確動物寄生蜱種類分布和預防蜱傳病提供科學依據．

1 材料與方法

1.1 樣本的采集

樣本從重慶市榮昌區中華田園犬體表獲得， 檢查犬耳、 頸部、 腹股溝、 腿根等部位， 發現蜱后用鑷子夾住假頭基緩慢拔出， 放入樣本管內編號、 記錄． 用75%酒精漂洗3次， 再用滅菌蒸餾水沖洗3次后70%酒精保存．

1.2 蜱形態學鑒定

參照《中國經濟學昆蟲志》[9]， 用體式顯微鏡(ZSA0745B)對蜱進行形態學鑒定， 主要對假頭、 盾板、 肛側板等部位進行測量觀察．

1.3 蜱分子生物學鑒定

1.3.1 主要試劑

PCR試劑(MgCl2、 Buffer、 dNTPs等)、 Taq DNA聚合酶、 DL 2000 DNA Marker、 瓊脂糖、 Amp、 X-gal、 IPTG、 重組質粒pMD19-T(Simple) Vector購自TaKaRa公司； 胰蛋白胨(Tryptone)、 酵母浸出粉(Yeast extract)購自Oxiod公司； 蛋白酶K購自Merk公司； DNA膠回收試劑盒、 DH5α感受態細胞購自TransGen Biotech公司．

1.3.2 DNA的提取

取出單只蜱置于新的1.5 mL Eppendorf管中， 用滅菌眼科剪將蜱組織剪碎， 加入270 μL SDS裂解液(包括60 μL 500 mmol/L NaCl溶液， 30 μL 100 mmol/L Tris-Cl(pH=8.0)， 30 μL 10% SDS， 150 μL 50 mmol/L EDTA(pH=8.0))和30 μL 50 μg/μL蛋白酶K， 充分混勻， 隔夜55 ℃水浴12～24 h， 其間多次振蕩混勻離心管使組織裂解充分后采用酚/氯仿法抽提樣本DNA． 提取出的DNA 樣品于-20 ℃冰箱保存備用．

1.3.3 PCR擴增

根據文獻[10]提供的線粒體保守引物16SrDNA進行擴增， 預期目的片段約460 bp． 其核苷酸序列如下：

上游引物16S-F： 5′-CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG-3′(29 bp)

下游引物16S-R： 5′-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT-3′(22 bp)

由重慶擎科興業生物技術有限公司合成， 使用時加滅菌超純水稀釋， 濃度為10 μmol/L， 分裝后于-20 ℃保存備用． PCR反應體系為25.0 μL， 其中3.0 μL Mg2+(25 mmol/L)， 2.0 μL dNTPs(2.5 μmol/L)， 2.5 μL 10×PCR buffer(不含Mg2+)， 0.25 μL上游引物16S-F(10 μmol/L)， 0.25 μL下游引物16S-R(10 μmol/L)， 2.0 μL模板DNA， 0.125 μL rTaq酶(5 U/μL)， 滅菌雙蒸水14.875 μL． 反應在PCR儀BIO RAD S1000上進行， 反應參數為預變性94 ℃ 5 min， 變性94 ℃ 30 s， 退火溫度57 ℃ 30 s， 延伸72 ℃ 30 s， 循環反應35次， 最后72 ℃ 延伸8 min， 同時設置陰性對照組． PCR產物經10 g/L TAE瓊脂糖凝膠電泳后成像系統顯示記錄分析結果．

1.3.4 PCR產物的克隆及測序分析

DNA膠回收試劑盒切膠純化PCR產物． 將回收的PCR產物與pMD19-T(simple)Vector載體16 ℃ PCR擴增儀連接1 h． 連接后將上述連接產物轉化至DH5α感受態細胞， 涂布于含Amp，X-gal和IPTG的LB瓊脂平板中， 置恒溫箱37 ℃培養12～14 h．

挑取陽性克隆菌液送重慶擎科興業生物技術有限公司測序． 將測序結果與國際NCBI數據庫Blast核酸比對， 同時基于16SrDNA序列下載了雙棘血蜱H.bispinosa(GeneBank NO. KY825195)、 豪豬血蜱H.hystricis(GeneBank NO. LT593116)、 嗜群血蜱H.concinna(GeneBank NO. KP866207)、 日本血蜱H.japonica(GeneBank NO. AB819176)、 青海血蜱H.qinghaiensis(GeneBank NO. MF629896)， 波斯銳緣蜱Argaspersicus(GeneBank NO. GU451248)， 龜形花蜱Amblyommatestudinarium(GeneBank NO. KC170737)， 微小牛蜱Boophilusmicroplus(GeneBank NO. AY974242)， 雞蜱刺螨Dermanyssusgallinae(GeneBank NO. LC029798)， 草原革蜱Dermacentornuttalli(GeneBank NO. MK032591)， 殘緣璃眼蜱Hyalommadetritum(GeneBank NO. KP210065)， 全溝硬蜱Ixodespersulcatus(GeneBank NO. MF095807)， 柏氏禽刺螨Ornithonyssusbacoti(GeneBank NO. AM921905)， 血紅扇頭蜱Rhipicephalussanguineus(GeneBank NO. JX997393)， 用MEGA 4.0構建種系發育進化樹， 明確該蜱與其他蜱種的親緣關系(圖1)．

圖1 基于16S rDNA序列構建的H. longicornis系統發育分析

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定

在體式顯微鏡下可明顯觀察到其形態特征： 軀體背部有堅硬盾板， 邊緣呈均勻的弧狀， 軀體尾部皮紋清楚， 緣垛明顯， 共有11個(圖2a)． 軀體腹面足四對， 生殖孔位于腹前部正中、 Ⅱ-Ⅲ基節間， Ⅱ-Ⅳ基節內距明顯超過體后緣， 粗細均勻中等， 基節Ⅰ呈錐形， 內距發達， 后緣不分叉(圖2b)． 假頭背面， 須肢寬短， 外緣向外側中度突出， 呈角狀， 第Ⅱ節背面有三角形短刺， 腹面有錐形的長刺， 假頭基呈矩形(圖2c)． 氣門板位于第Ⅳ基節后部， 呈D字隆起， 左右對稱(圖2d)， 經形態學初步鑒定為長角血蜱． 選取樣本3株進行后續試驗(表1)．

圖2 長角血蜱的形態特征

表1 本試驗所用長角血蜱樣本

2.2 分子生物學鑒定

2.2.1 PCR擴增產物結果

擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示， 3株樣本在約460 bp處可見明顯條帶， 與預期片段大小相符， 陰性對照沒有出現條帶(圖3)．

M. DNA相對分子質量標準； 1. H. longicornis-RC 16S PCR； 2.H. longicornis-RCF 16S PCR； 3. H. longicornis-RCM 16S PCR； 4.陰性對照．

2.2.2 重組質粒的菌液PCR鑒定

陽性克隆的重組質粒菌液PCR擴增后經瓊脂糖凝膠電泳顯示， 3株樣本重組質粒菌液擴增出約460 bp的16SrDNA條帶， 與預期片段大小相符， 陰性對照沒有出現條帶(圖4)．

M. DNA相對分子質量標準； 1. H. longicornis-RC重組菌液PCR； 2. H. longicornis-RCF重組菌液PCR； 3. H. longicornis-RCM重組菌液PCR； 4.陰性對照．

2.3 測序結果及種系發育進化樹分析

對PCR鑒定為陽性的重組菌液測序， 結果顯示3株樣本獲得的PCR產物序列長度基本一致， 為457～458 bp， 僅RC株有一個堿基的差異(163 bp處缺少堿基A)． 經NCBI網站Blast比對， 本研究獲得的蜱16SrDNA序列與H.longicornis(GeneBank NO. JX051073，KJ710087，MT555304，MN956526)進行分析， 結果顯示其同源性達99.3%～99.6%． 將本次研究測序所得的3株H.longicornis序列與下載的18株序列應用程序MegAlign 4.0 中的NJ構建種系發育進化樹(圖1)， 顯示3株H.longicornis重慶市榮昌區分離株與GeneBank登記的H.longicornis(GeneBank NO. JX051073，KJ710087，MT555304，MN956526)位于同一個分支上， 表明其均為同一個物種． 本研究獲得的蜱16SrDNA序列與GeneBank上收錄的豪豬血蜱H.hystricis(GeneBank NO. LT593116)的遺傳距離最近， 與微小牛蜱B.microplus(GeneBank NO. AY974242)的遺傳距離最遠．

3 結 語

長角血蜱在分類上屬于硬蜱科Ixodidae， 血蜱屬Haemaphysalis， 已在我國多個省區發現該蜱， 是最為常見的蜱種之一． 由于蜱不僅在動物體表叮咬吸血使得宿主失血較多出現貧血消瘦癥狀， 經久不愈影響生產性能， 而且由于叮咬降低動物表皮商品質量， 給畜牧養殖產業造成巨大的經濟損失． 長角血蜱更是多種重要疾病的傳播媒介， 可將多種疾病如Q熱、 萊姆病、 某些巴貝斯蟲病等傳給人類， 對人類健康構成較大的威脅， 并且不斷有新發的蜱傳病原被檢測出， 如近年來研究證實長角血蜱可作為發熱伴血小板減少綜合癥病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus， SFTSV)的中間宿主[10]， 能引起機體發熱伴血小板減少(Severe fever with thrombocytopenia syndrome， SFTS)．

蜱在全球分布范圍廣， 目前全世界記載蜱種有3科共899種[11]， 我國已記錄蜱有9屬124種[12]， 種類繁多， 外觀形態上有許多相似物種， 并且由于其表型可塑性、 地區遺傳多樣性和生長環境不同， 同一物種不同個體間也有差異， 常易導致鑒定錯誤． 僅憑形態學特征對蜱進行物種鑒定要求研究者具備豐富的專業知識儲備， 這種鑒定具有一定的難度． 因此， 借用分子生物學技術準確鑒定蜱的方法普遍被人們所接受．

動物線粒體DNA(mtDNA)以高拷貝數目存在于線粒體內， 主要有16SrDNA，12SrDNA，COXI和COXII等基因， 目前已被廣泛應用于蜱類系統發育、 種群遺傳變異與分化以及形態學上難以區分的近緣種的鑒別等． 16SrDNA是動物線粒體內較為保守的基因， 具有進化速率緩慢， 以替換為主的特點， 可以很方便地使用通用引物或者保守引物進行PCR擴增[13-14]． 研究證實16SrDNA能作為H.longicornis分類鑒定和群體遺傳研究的分子標記， Lv等[15]利用16SrDNA分子標記對湖北省鈴頭血蜱和褐黃血蜱進行種屬鑒定； 劉琴等[16]基于16SrDNA序列探討了長角血蜱、 褐黃血蜱及鈴頭血蜱的系統發育進化關系． 本試驗以H.longicornis為對象開展研究， 測序結果顯示3株H.longicornis的16SrDNA序列基本一致， 僅RC株位于163 bp處有堿基差異； 種系發育進化分析顯示3株樣本與GeneBank上收錄的H.hystricis遺傳距離最近， 在分類上H.longicornis與H.hystricis同歸于血蜱屬， 證實了16SrDNA是H.longicornis進行種間鑒定的遺傳標記． 本文對重慶市榮昌區媒介蜱進行研究報道， 為后續該蜱類鑒定、 遺傳分析及蜱傳病防治等研究奠定了基礎．