飼養條件對水牛精液品質及精漿代謝物的影響分析*

孫 樂，劉瑞鑫，許春榮，許 鵬，石德順，李湘萍

1. 廣西大學 亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室， 南寧 530004；2. 廣西壯族自治區畜禽品種改良站， 南寧 530001

種公牛精液品質的好壞會直接影響到精液的生產、 種公牛的繁殖性能以及畜禽品改站的經濟效益． 影響精液品質的因素有很多， 包括溫度、 品種、 營養條件、 飼養管理等． 有研究報道精液生產能力主要取決于環境， 其中最主要的是飼養管理條件[1-3]． 目前， 有關營養條件的研究集中于飼養后生理和生化指標的檢測， 通過這些指標來反映營養條件改變給動物機體帶來的影響． 有研究在飼料中添加Penergetic-T后分析其對瘤胃液和血液生化指標的影響， 以反映飼料添加劑對延邊黃牛育肥的促進作用[4]． 改善日糧比例， 如在飼料中添加益生菌可降低肉雞料肉比[5]， 提高斷奶仔豬生長性能[6]， 促進0～8月齡犢牛日增質量[7]， 提高和牛種公牛的精液品質[8]， 此外， 有學者在研究不同日糧對冬季摩拉、 尼里/拉菲種公牛凍精的影響時， 提出青綠飼料對提高種公牛的精液品質有重要作用[9-10]．

代謝組學可以對某一生物體組份或細胞在特定生理時期或條件下所有代謝產物同時進行定性和定量分析， 以尋找目標差異代謝物、 進而研究機體代謝特征． 代謝組研究在動物健康評估、 疾病診斷、 生物產品質量方面發揮了重大作用[11-13]． Beauclercq等[14]通過代謝組學找出了15種可能影響雞肉品質的標志代謝物． 朱坤等[15]指出飼喂發酵飼料影響了育肥豬血清中L-焦谷氨酸、 黃嘌呤、 丙烯酰胺等代謝物的含量， 揭示了飼喂不同飼料會造成育肥豬血清代謝水平的改變． 趙文華等[16]通過代謝組學研究揭示了γ-氨基丁酸、 組氨酸和甜菜堿對茶花雞胸肌和腿肌的特殊風味具有決定作用． Li等[17]利用代謝組學技術分析不同泌乳期的牦牛乳腺組織代謝變化， 發現受影響的代謝途徑是甘氨酸、 絲氨酸和蘇氨酸； 三羧酸循環(TCA)等代謝途徑， 為牛乳腺發育和泌乳相關的代謝研究提供了重要的支撐． 目前有關精漿代謝組學分析較少， 羅芳等[18]在篩選表征種公牛精液活力生物標志物的實驗中， 采集24頭西門塔爾種公牛的精液進行超高效液相色譜-質譜聯用檢測， 發現精漿中的鞘氨醇、 環己胺、 戊酸等6個代謝物可作為表征種公牛精液活力的潛在生物標志物． Ugur等[19]使用氣相色譜-質譜聯用技術對不同冷凍性荷斯坦種公牛精漿中的氨基酸含量進行了定量分析， 發現牛精漿中谷氨酸、 丙氨酸和甘氨酸是主要代謝產物， 同時發現苯丙氨酸可以作為一種可冷凍的生物標志物．

意大利地中海奶水牛是產奶性能最好的河流型水牛品種， 同時也是目前世界上針對乳用性能選育程度較高的一個品種． 隨著奶水牛市場需求的不斷擴大， 為提高本地水牛的產奶量和奶質量， 廣西壯族自治區引進了意大利地中海種公牛， 以期對廣西本地水牛進行品種改良． 基于營養條件可能會影響種公牛精液品質， 同時有關水牛精漿代謝成分研究尚為空白的前提， 本研究主要分析不同飼養條件下種公牛精液質量、 生化指標及精漿代謝物， 并篩選出不同營養條件下的差異代謝物， 以期為進一步選擇優質飼料飼喂種公牛， 提高精液產量和質量提供一定的科學依據．

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗用意大利地中海種公牛， 飼養在廣西壯族自治區畜禽品種改良站種公牛站． 試驗動物按照廣西畜禽品種改良站種公牛飼養與管理的相關條例進行飼養． 根據采精和凍精生產記錄， 選擇采精正常、 體況良好的種公牛為試驗牛． 分為飼喂青綠飼料GF組、 青貯飼料S組． 采集不同飼養條件下的精液樣本， 取回的精液進行離心， 分離后的精子和精漿進行分裝， 冷凍于液氮中， 隨后放入-80 ℃保存備用．

1.2 主要試劑

伊紅染液、 磷酸鹽緩沖液(PBS)、 生育酚乙酸酯、 甲醇、 酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒牛甘油三酯(TG)、 牛睪酮(T)、 牛堿性磷酸酶(ALP)、 牛酸性磷酸酶(ACP)、 牛果糖(fructose)、 牛α葡萄糖苷酶(α-Glu)、 牛乳酸脫氫同工酶(LDH)均購自上海酶聯生物科技有限公司； 鉀(K)測定試劑盒、 鎂(Mg)測定試劑盒、 鈉(Na)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所．

1.3 主要儀器、 設備

精子分析儀WLJY-9000型(富士平工業株式會社)， 0.22 μm離心過濾柱， C18色譜柱， 液相色譜儀器UltiMate3000(Dionex)， 包括液相泵(HPG-3400 SD)、 柱溫箱(TCC-3000 SD)和自動進樣器(WPS-3000SL)， 四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀Q-Exactive(Thermo Scientific)．

1.4 實驗方法

1.4.1 精液品質常規檢測

精子活力檢測： 在顯微鏡下用精液質量檢測系統進行分析， 每個樣本重復計數3次并記錄結果． 精子畸形率檢測： 采用伊紅染色法進行精子畸形觀察． 采精量檢測： 利用電子分析天平記錄射精量． 精液pH值檢測： 利用pH試紙與標準比色卡對比得出pH值． 計算機輔助精子分析儀檢測： 取2 μL精液， 8 μL PBS洗液， 混勻后上機檢測， 利用精子分析儀對種公牛精子進行運動參數分析．

1.4.2 意大利地中海種公牛精漿生化指標檢測

按照試劑盒說明書方法測定意大利地中海種公牛精漿的生化指標．

1.4.3 意大利地中海種公牛精漿非靶向代謝組學檢測

(1) 精漿代謝物的提取

取50 μL分離得到的精漿樣本， 加入148 μL甲醇， 2 μL內標(生育酚乙酸酯)至1.5 mL 離心過濾器， 渦旋30 s， 沉淀蛋白， 4 ℃離心12 000 r/min， 15 min， 取出過濾柱．

(2) QC樣品制備

質量控制樣本(QC)為精漿提取物的混合液， 每6個檢測的樣本插入一個QC樣本， 用來校正儀器的穩定性．

(3) 超高效液相色譜-串聯質譜檢測

液相色譜條件如下： 色譜柱柱溫30 ℃， 自動進樣器4 ℃， 正離子(ESI+)模式下流動相A為0.1%的甲酸水溶液， 流動相B為甲醇， 進樣體積為1 μL， 負離子模式其他條件不變， 只改變模式為負離子(ESI-)． 樣品梯度洗脫程序參考實驗平臺方法． 質譜條件： 離子源為Q-Exactive質譜儀， 加熱型電噴霧， 溫度300 ℃， 正、 負離子模式下噴霧電壓均為3.0 kV， 傳輸毛細管溫度為320 ℃， 鞘氣和輔助氣流壓力分別為30 psi(206.84 kPa)， 10 psi(68.95 kPa)； 質譜掃描范圍為80～1 200 m/z(質子與電荷數的比值)， 掃描模式： Full MS/dd-MS2．

1.5 數據統計分析

對數據指標進行統計分析， 結果均以“平均值±標準差”表示， 利用GraphPad Prism 6.0進行圖片整理并進行差異顯著性分析， **表示p<0.05差異顯著， ***表示p<0.01差異極顯著．

2 結果與分析

2.1 種公牛精液常規檢測

與青貯飼料組相比， 青綠飼料組種公牛精子活力和采精量顯著升高， 畸形率顯著下降(p<0.05)， 精液pH值和密度沒有顯著差異(p>0.05)． 青綠飼料組精子直線速度(VSL)、 曲線速度(VCL)、 平均速度(VAP)、 鞭打頻率(BCF)均顯著升高(p<0.05)， 精子直進性(LIN)和直線性(STR)極顯著升高(p<0.01)， 頭部振幅(ALH)沒有顯著差異(p>0.05)(表1)．

表1 種公牛精液質量參數

2.2 種公牛精漿生化指標分析

與青貯飼料組相比， 青綠飼料組種公牛精漿中鎂(Mg2+)、 果糖(Fructose)含量均顯著升高(p<0.05)， 鉀(K+)、 睪酮(T)、 α-葡萄糖苷酶(α-Glu)、 酸性磷酸酶(ACP)、 堿性磷酸酶(ALP)、 乳酸脫氫同工酶(LDH)含量極顯著升高(p<0.01)， 鈉(Na+)含量差異不顯著(圖1)．

圖1 精漿生化指標在兩組中的含量

2.3 精漿非靶向代謝組學分析

在正離子模式和負離子模式下， 本次實驗共檢測到2 434個峰值． 代謝組學原始數據采用Compound discover 3.0軟件進行峰對齊、 保留時間校正以及提取代謝物峰面積計算， 同時去除相對標準偏差(RSD)大于30%的代謝物． 通過代謝物數據庫mzCloud，HMBD和KEGG匹配檢索， 一共匹配出677個不同的代謝物．

2.3.1 精漿代謝物分析

從主成分分析(PCA)得分圖可知， 本次實驗QC樣品分布良好， 說明所用儀器重復性及穩定性均好， 同時不同組間有明顯的分布趨勢(圖2)．

t[1]是針對預測主成分的回歸系數權重大小， t[2]是針對正交主成分的回歸系數權重大小．

對代謝物進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)以區分組， 在正、 負離子模式下的模型示意圖說明模型穩定可靠性． 對所建立的OPLS-DA模型進行置換檢驗， 也表明本文所建立的模型有效并且未發生過擬合(圖3)．

t[1]是第一預測主成分， to[1]是第一正交主成分．

2.3.2 精漿差異代謝物的篩選及代謝途徑分析

根據p<0.05，VIP>1且差異倍數FC值大于1.3或者差異倍數FC值小于0.7， 共篩選出10個差異代謝物： 左旋乙酰肉堿、 甘油磷酸膽堿、 3-丁酸巰基己酯、 3-氧戊二酸、 甜菜堿、 5-甲基胞苷、 2， 5-呋喃二甲酸、 檸檬酸、 磷脂酰膽堿和檸康酸． 對差異代謝物進行代謝途徑分析， 發現差異代謝物參與9條代謝途徑： 甘油磷脂代謝， 亞油酸代謝， α-亞麻酸代謝， 醚脂質代謝， 三羧酸循環， 丙氨酸、 天冬氨酸和谷氨酸代謝， 乙醛酸和二羧酸酯代謝， 甘氨酸、 絲氨酸和蘇氨酸代謝， 花生四烯酸代謝．

3 討論與結論

本文的目的是了解在不同飼養條件下種公牛精液質量和精漿代謝的差異． 研究發現， 與青貯飼料組相比， 青綠飼料組種公牛精子畸形率低、 活力高， 精液品質好． 同時， 本實驗對青綠飼料組和青貯飼料組種公牛的精漿樣本進行了超高效液相色譜-串聯質譜分析， 通過差異分析和代謝途徑分析， 篩選出了10種差異代謝物， 富集到9個代謝途徑．

精漿中包含糖類、 脂類、 蛋白質和氨基酸等物質． 在不同生理狀態下， 能量、 蛋白質、 礦物質和維生素等對公畜生殖能力的維持起到重要作用． 精漿內的微量元素與精子功能有關， 鈉、 鈣、 鎂和鉀水平與精子活動率呈正相關． 在本研究中， 與青貯飼料組相比， 青綠飼料組精漿中Mg離子顯著升高， K離子變化極顯著升高， Na離子差異不顯著， 這一點與之前的研究一致[20-21]． 睪酮影響精子形成并促進附睪中的精子成熟[22]． 種公牛精漿中睪酮含量極顯著升高， 也說明睪酮含量對于精子成熟十分重要． 精漿中的糖類是精子能量代謝的重要底物， 尤其果糖是精子能量代謝的主要來源， 其代謝能為精子運動供應腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)， 同時經糖酵解和線粒體呼吸作用產生的ATP為精子的運動提供能量[23]． 果糖水平升高， 意味著供能物質充足， 有利于代謝． 哺乳動物精液中中性α-葡萄糖苷酶幾乎完全來源于附睪， 與獲得受精能力相關， 同時作為附睪精子成熟的調節劑[24-25]． 中性α-葡萄糖苷酶活性與常規精子參數呈正相關， 在本研究測得的指標中睪酮、 果糖和α-葡萄糖苷酶在青綠飼料組極顯著升高， 可以發現不同飼料對精子的成熟和能量代謝產生了一定的影響．

精漿中的肉堿主要由附睪分泌， 精漿中肉堿分為游離肉堿和乙酰肉堿兩種． 左旋肉堿為精子的運動提供能量， 并且可以幫助細胞內DNA修復和支持細胞的新陳代謝[26]． 左旋肉堿和乙酰左旋肉堿對弱精子癥具有輔助治療效果， 能提高患者的精液質量[27]． 還有研究發現， 乙酰肉堿含量與總運動形態正常的精子數呈正相關， 口服左旋肉堿的種馬可改善精子的動力學和形態學特征[28]， 可見左旋乙酰肉堿對保持精子的正常形態和活力有一定的影響． 在實驗中的質譜分析可以發現， 左旋乙酰肉堿在青綠飼料組中含量高， 同時青綠飼料組精子活力也高， 這表明左旋乙酰肉堿與精子的活力有一定的關系．

甘油磷酸膽堿(GPC)是存在于雄性生殖系統中的一種主要成分， 絕大部分由附睪上皮合成與分泌， 有研究指出精漿GPC量約占人體內GPC總量的70%以上， 是檢驗雄性生殖能力的指標之一， 并且GPC參與精子運動的調節及吸呼活動， 精子膜GPC含量與附睪功能具有密切的聯系[29-30]． 磷脂酰膽堿屬于卵磷脂的一種， 卵磷脂經常用于冷凍精液保存． 甜菜堿是一種生物堿， 與葉酸一起參與碳代謝， 它可以通過清除超氧化物來提高睪丸組織的抗氧化能力， 并且可以通過甜菜堿循環產生S-腺苷甲硫氨酸來提高精子運動能力和精子功能． 于炎巧[31]研究發現甜菜堿能夠提高精子數量， 改善精子活力， 且不會改變精子的畸形率． 此外， 其他代謝物如5-甲基胞苷常存在于細胞的RNA中， 是一種稀有核苷． 2， 5-呋喃二甲酸可進行糖醛降解， 產生能量和生成α-酮戊二酸， 為TCA循環增加底物． 3-丁酸巰基己酯是脂肪酸酯類有機化合物， 它是脂肪酸的羧酸酯衍生物． 在實驗中的質譜分析可以發現， 上述的甘油磷酸膽堿、 磷脂酰膽堿、 甜菜堿、 5-甲基胞苷、 2，5-呋喃二甲酸和3-丁酸巰基己酯， 在青綠飼料組中的含量高．

檸檬酸是三羧酸循環過程中的重要物質， 三羧酸循環是基本的代謝途徑， 為相關代謝提供能量和前體， 保證各種生物功能正常進行， 同時在精子激活和運動期間產生能量[32-33]， 如精子在附睪內的成熟過程中主要是通過代謝來提供能量， 精漿內的檸檬酸含量可以在一定程度上反映精子的活力． 檸檬酸是精漿中重要的生化成分， 不僅能夠恢復前列腺的狀態， 在精子活力中還起著至關重要的作用[34]． 精漿中的檸檬酸主要來自前列腺， 可以調節酸堿度， 同時影響精液質量． Kumar等[35]利用質子核磁共振技術對高繁殖力和低繁殖力種公牛精漿和血清中的代謝產物進行研究， 發現精漿中的檸檬酸與種公牛生育能力有關． 在實驗中的質譜分析發現， 檸檬酸在青綠飼料組中的含量較高， 這可能與精漿中的能量代謝相關．

本研究結果說明， 營養條件的改變會對意大利地中海種公牛精液質量和生理代謝產生影響， 并影響精漿代謝水平．