一株豬源化膿隱秘桿菌的分離鑒定及對促炎細胞因子分泌的影響*

田尚全， 王近禮， 易文毅， 譚靜梅，冉金鑫， 王芝英，2， 周作勇，2

1. 西南大學 動物醫(yī)學院， 重慶 榮昌 402460； 2. 重慶市獸醫(yī)科學工程研究中心， 重慶 榮昌 402460

化膿隱秘桿菌Trueperellapyogenes以前被稱為化膿放線菌Actinomycespyogenes和化膿棒狀桿菌Corynebacteriumpyogenes， 屬于放線菌科Actinomycetaceae隱秘桿菌屬Arcanobacterium[1]． 化膿隱秘桿菌是一種重要的條件性致病菌， 主要感染豬、 牛、 羊等多種動物和人， 引發(fā)皮下、 內(nèi)臟器官及肌肉組織膿腫， 亦可造成肺炎、 胸膜炎、 關(guān)節(jié)炎、 心內(nèi)膜炎和乳腺炎等多種病癥， 給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大的經(jīng)濟損失[1]． 化膿隱秘桿菌感染致病與其表達的毒力因子有關(guān)， 目前報道的毒力因子包括溶血素(Plo)[2-3]、 膠原結(jié)合蛋白(CbpA)、 神經(jīng)氨酸酶(Nan)及菌毛合成蛋白(Fim)等[4-7]， 這些毒力因子在該病原感染致病中發(fā)揮重要作用．

本實驗室從重慶市璧山區(qū)一起屠宰豬肉中出現(xiàn)的草綠色化膿病料樣本中分離出一株溶血性極強的細菌， 經(jīng)常規(guī)形態(tài)學鑒定、 16SrRNA測序分析、 毒力基因和耐藥譜檢測， 將其鑒定為化膿隱秘桿菌． 結(jié)合化膿隱秘桿菌感染宿主后主要引起炎性膿腫的致病特征， 研究其作用巨噬細胞對促炎細胞因子IL-6和TNF-α分泌的影響， 以期為豬化膿隱秘桿菌病的防控及致病機理研究提供參考．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源

重慶市璧山區(qū)一起屠宰豬肉中出現(xiàn)的草綠色粘稠的膿汁(圖1a)， 以滅菌離心管采集后， 低溫冷藏送檢．

圖1 BS-1菌株的來源樣本、 分離培養(yǎng)及染色鏡檢結(jié)果

1.1.2 主要試劑及細胞

藥敏紙片購于杭州濱和微生物試劑有限公司； Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、 preMix 2× Taq和DNA Marker購于大連寶生物有限公司； 胎牛血清購自于 Biological Industries 公司； IL-6和TNF-α ELISA 檢測試劑盒購自Thermo Fisher Scientific(USA)． J774A.1巨噬細胞由西南大學動物科學學院周洋博士惠贈．

1.1.3 檢測引物

以Li等[8]報道的細菌16SrRNA基因及Rzewuska等[9]報道的化膿隱秘桿菌Plo，CbpA，NanP，NanH，F(xiàn)imA和FimC毒力基因引物為檢測引物(表1)， 由上海百力格生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成．

表1 化膿隱秘桿菌16S rRNA和主要毒力基因擴增引物

1.1.4 試驗動物

C57BL/6小鼠， 體質(zhì)量18～22 g， 購自重慶市中藥研究院．

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的分離鑒定及致病性試驗

將病料接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基上， 37 ℃培養(yǎng)48 h， 觀察菌落形態(tài)． 挑取單個菌落純化培養(yǎng)和革蘭氏染色鏡檢． 將分離菌(BS-1)菌液按0.3 mL/只(1.2×109CFU/mL)腹腔注射C57BL/6小鼠， 觀察其致病性．

用Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR裂解細菌獲得基因組DNA， 以16SrRNA引物進行PCR擴增． PCR擴增體系為基因組DNA 2 μL， premix 2×Taq 12.5 μL， 上、 下游引物各1 μL， 用dd H2O補至25 μL． PCR擴增條件為94 ℃ 預變性5 min； 94 ℃ 變性30 s， 54 ℃ 退火30 s， 72 ℃延伸1.5 min， 30個循環(huán)； 72 ℃ 延伸10 min． 經(jīng)電泳檢測后， 將PCR 產(chǎn)物送往重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司測序． 測序結(jié)果進行BLAST在線相似度比對． 以放線菌科的偽結(jié)核棒狀桿菌Corynebacteriumpseudotuberculosis16SrRNA為外群， 選取豬、 山羊、 綿羊和牛源化膿隱秘桿菌T.pyogenes、 感染人的溶血隱秘桿菌Arcanobacteriumhaemolyticum、 感染狐和貂的phocae隱秘桿菌A.phocae16SrRNA序列(表2)， 以CLUSTAL X進行多重序列比對， 采用 MEGA 8.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹， 分析BS-1株的16SrRNA聚類情況．

表2 用于化膿隱秘桿菌系統(tǒng)進化分析的16S rRNA序列

1.2.2 分離菌藥敏試驗

將分離菌(BS-1株)接種于含10%血清的LB(lysogeny broth)肉湯中， 37 ℃培養(yǎng)48 h， 制成 0.5個麥氏單位的菌懸液， 吸取100 μL均勻涂布在鮮血瓊脂平板表面， 待菌液吸收后， 貼上藥敏紙片， 37 ℃培養(yǎng)48 h， 記錄抑菌圈大小．

1.2.3 分離菌毒力基因檢測

制備BS-1株的基因組DNA， 檢測毒力基因攜帶情況． PCR擴增條件為94 ℃預變性10 min； 94 ℃變性30 s， 57 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1.5 min， 35個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min． PCR擴增產(chǎn)物分別用4%(Plo，CbpA，NanP)和1%(NanH，F(xiàn)imA，F(xiàn)imC)的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測．

1.2.4 分離菌株對巨噬細胞IL-6和TNF-α分泌的影響

培養(yǎng)BS-1株菌液， 以感染復數(shù)為10(MOI=10)作用J774A.1巨噬細胞1 h， 更換含慶大霉素培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)， 24 h后收集培養(yǎng)上清， 按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6和TNF-α含量． 用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)差異性．

2 試驗結(jié)果

2.1 細菌的分離鑒定結(jié)果

以待檢膿汁劃線接種后分離獲得形態(tài)單一、 溶血性極強(呈β溶血)約1 mm大小的菌落， 其表面光滑， 呈半濕潤狀、 灰白色(圖1b、 圖1c)． 染色鏡檢顯示該分離菌(BS-1)為革蘭氏陽性桿菌， 呈散在分布的形態(tài)多樣的短小桿菌(圖1d)． BS-1株接種3 h后， 小鼠表現(xiàn)為精神萎靡、 反應遲鈍、 動作緩慢等癥狀， 并于7 h內(nèi)全部死亡， 解剖發(fā)現(xiàn)肝腫大、 脾腫大且有出血點． 對照組小鼠無明顯眼觀癥狀和死亡．

對BS-1株16SrRNA基因擴增獲得1 500 bp左右的條帶(圖2a)， 測序及系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)該菌16S rRNA序列與化膿隱秘桿菌序列相似度較高， 其中與NIAH13535株(LC500012.1)相似度最高， 為97.26%． 系統(tǒng)進化分析顯示， 該菌與化膿隱秘桿菌聚類到一個分支(圖2b)． 結(jié)合病原形態(tài)特征， 將該BS-1株鑒定為化膿隱秘桿菌．

M為DL2000 DNA Marker， 1為BS-1株， 2為空白對照．

2.2 BS-1株的藥敏試驗結(jié)果

根據(jù)美國實驗標準委員會(NCCLS)藥敏紙片擴散法規(guī)標準， 以常見的18種抗菌藥物進行藥敏試驗， 發(fā)現(xiàn)BS-1株僅對克拉霉素和羅紅霉素中度敏感， 而對青霉素G、 慶大霉素、 萬古霉素、 諾氟沙星、 氯霉素、 米諾環(huán)素(甲)、 阿莫西林等耐藥(表3)．

表3 BS-1株的藥敏試驗結(jié)果

2.3 BS-1株的毒力基因檢測結(jié)果

毒力基因檢測顯示BS-1株攜帶有Plo，NanP，NanH和FimA共4個毒力基因， 未檢測到CbpA和FimC基因(圖3)．

圖3 BS-1株毒力基因檢測結(jié)果

2.4 BS-1株感染對J774A.1巨噬細胞IL-6和TNF-α分泌的影響

化膿隱秘桿菌感染宿主后所引起的化膿性病變本質(zhì)為炎癥反應， 因此本研究檢測了該病原感染巨噬細胞后促炎細胞因子分泌情況． 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 與未受感染的J774 A.1巨噬細胞相比， BS-1株感染巨噬細胞IL-6和TNF-α 分泌水平顯著增加(圖4)．

UI代表未感染對照組； Tp代表化膿隱秘桿菌BS-1； *表示p<0.05， 差異具有統(tǒng)計學意義； **表示p<0.01， 差異具有統(tǒng)計學意義．

3 結(jié) 語

化膿隱秘桿菌與馬紅球菌及偽結(jié)核棒狀桿菌相似， 均為放線菌屬病原中引起化膿性感染的重要病原[1]． 近年來關(guān)于該病原感染豬的病例報道漸多， 其分離地點包括廣東、 上海、 吉林、 河南、 天津和四川等地[4， 10-16]， 表明化膿隱秘桿菌感染豬致病的現(xiàn)象日益嚴重． 化膿隱秘桿菌可與副豬嗜血桿菌、 多殺性巴氏桿菌、 致病性大腸桿菌混合感染， 對豬的致病性增強， 為疾病診斷和防治帶來很大的困難[10， 16]． 本文從重慶地區(qū)屠宰豬的肌肉膿汁中分離出具有較強致病力的化膿隱秘桿菌， 提示當?shù)仞B(yǎng)豬場需注意對該病原做好防控工作． 掌握病原菌對藥物的敏感性情況是有效防控其感染致病的關(guān)鍵， 本研究發(fā)現(xiàn)化膿隱秘桿菌BS-1株僅對克拉霉素和羅紅霉素中度敏感， 而對青霉素G、 萬古霉素、 諾氟沙星、 氯霉素、 阿莫西林等耐藥， 與Santos等[17]的研究結(jié)果類似． 這可能與近年來該地區(qū)部分豬場不合理使用抗菌藥物有關(guān)．

病原菌毒力基因的攜帶水平大都與其致病能力密切相關(guān)， 蔡瑤等[10]報道分離自四川浦江的豬源化膿隱秘桿菌攜帶有plo，NanH，F(xiàn)imA，F(xiàn)imC和FimG基因， 無NanP，CbpA和FimE基因． 董文龍等[14]報道分離自吉林省的8株豬源化膿隱秘桿菌均攜帶有Plo基因， 但均缺失CbpA基因，NanH及NanP基因攜帶水平分別為25%和50%． 本研究發(fā)現(xiàn)BS-1株攜帶了Plo，NanP，NanH和FimA基因， 但沒有CbpA和FimC基因， 與蔡瑤等[10]和董文龍等[14]報道的化膿隱秘桿菌均攜帶有Plo基因相同， 而其他基因攜帶水平有一定的差異， 其原因可能與化膿隱秘桿菌不同來源地有關(guān)．

化膿隱秘桿菌感染宿主后主要引起炎性膿腫的致病特征， 促炎性細胞因子在該病原感染致炎中起了重要作用． TNF-α和IL-6均是由單核巨噬細胞等產(chǎn)生的重要促炎細胞因子， 與多殺性巴氏桿菌、 偽結(jié)核棒狀桿菌等病原感染巨噬細胞誘發(fā)大量的TNF-α和IL-6分泌相似[18-19]． 本研究表明化膿隱秘桿菌感染可誘發(fā)巨噬細胞大量分泌TNF-α和IL-6， 其誘發(fā)機理及在該病原感染致病中的作用機制有待進一步研究．

重慶璧山區(qū)該起屠宰豬肉中的膿腫病變由化膿隱秘桿菌感染引起， 該病原耐藥性較強， 攜帶有多種毒力基因， 可激活巨噬細胞分泌TNF-α和IL-6． 本研究為化膿隱秘桿菌的防控及致病機理研究提供了資料．