磁場真菌生物滴濾器去除三氯乙烯廢氣的研究*

王曼凝， 顏廷春， 耿 炎， 尹成日， 權 躍

1. 延邊大學 農學院， 吉林 延吉 133002； 2. 延邊大學 理學院， 吉林 延吉 133002；3. 延邊大學 地理與海洋科學學院， 吉林 延吉 133002

有機氯廢氣(Chlorinated Volatile Organic Compounds， Cl-VOCs)屬于美國環境保護署優先控制的污染物[1]． Cl-VOCs種類多， 應用廣， 此類污染物具有高揮發性、 外源性和持久性， 在環境中非常穩定， 難降解[2]． 大多數Cl-VOCs對人體具有致癌性， 排入大氣中易形成霧霾、 臭氧空洞、 光化學煙霧和溫室效應等環境問題[3]． 過去幾十年， 人們在生產和使用過程中將Cl-VOCs泄露到環境， 再加上不合適的末端處理方法， 使其在世界環境范圍內廣泛分布[4]． Cl-VOCs已經被劃分為有害有機污染物， 很多國家將其作為高度有害化學物質并列入減排的工作目標中[3]． 因此， 開發Cl-VOCs高效、 綠色治理技術已引起全世界的極大重視．

應用生物技術處理有機廢氣， 具有操作簡單、 經濟、 安全和無二次污染物等優點[5]． 其中生物滴濾器(Biotrickling filter， BTF)被廣泛應用于廢氣治理領域， 具有結構簡單、 壽命長、 壓降低、 耐酸的優勢[6]． 然而， 該技術在處理工業Cl-VOCs卻受到一定限制， 原因為： Cl-VOCs疏水性差， 氣液傳質弱； 另外其生物可利用性差； 多數Cl-VOCs還具有生物毒性， 導致微生物活性降低． 這些因素都是造成生物滴濾器應用效果差的原因[7]．

近年研究發現， 真菌由于獨特的生長環境和個體特性， 對難降解的有機物具有獨特的優勢， 可應用于降解多環芳烴、 染料等[8]． 真菌對惡劣環境具有更好的適應力和忍耐力， 能在低濕度、 低pH值的環境中生存， 比細菌對污染物具有更好的降解能力． 另外， 菌絲作為多數真菌營養生長的主要模式， 具有巨大比表面積， 增加了對污染物的吸收和傳質， 進而提高降解能力[9]．

磁技術在多個領域被廣泛應用， 如工農醫、 石油和水處理等領域， 具有經濟、 環保、 易操作等優點[10]． 近年來， 有報道稱在廢水生化處理中， 一定強度磁場可以提高廢水的處理能力[11]． 生物體均會受到外磁場、 環境磁場和體內磁場的影響， 磁性為物質的基本屬性[12]． 尤其是對于生物的生長， 弱磁場對其具有積極作用． 除此之外， 不同種類生物對相同的磁場強度反應也不同[13]．

三氯乙烯(Trichloroethylene， TCE)屬于典型的Cl-VOCs， 溶解力強， 被廣泛使用． 微溶水或以非水溶相游離于水中， 引起水環境問題． 另外， 揮發進入大氣， 形成溫室效應、 光化學煙霧、 臭氧層空洞、 霧霾等大氣污染[14]． TCE具有持久性、 難降解性， 無法被微生物直接降解， 原因為無法直接提供微生物生長的物質和能量， 但是可以被共代謝降解， 在共代謝基質所誘導出的酶和輔因子的作用下被降解[15]．

鑒于此， 本研究首次將磁場、 真菌和生物滴濾器進行耦合， 以提高對廢氣的去除效果． 以TCE為目標廢氣， 培養馴化降解TCE的混合真菌， 接種在以木片為填料的BTF中， 研究不同磁場強度下BTF對不同質量濃度TCE的去除性能， 并應用高通量測序技術首次對磁場與真菌群落結構和功能之間的關系進行了分析， 以期為磁場、 真菌和BTF耦合技術應用于疏水性VOCs的去除提供有效借鑒．

1 材料與方法

1.1 生物滴濾器的構建與啟動

反應流程見圖1， 內部填料為8～10 mm粒徑的木片，MFI分別為0， 20.0， 60.0， 80.0 mT， 接種菌液為已馴化好的真菌， 氣體流量為0.4 L/min， 空床停留時間(EBRT)為405 s． TCE的質量濃度1～15 d， 為24.6～204.6 mg/m3； 16～157 d， 為370～1 000 mg/m3.營養液為改良后的馬丁氏營養液， 生物滴濾器及啟動具體方法見已發表文獻[6]．

圖1 處理TCE的生物滴濾器

1.2 真菌的培養與馴化

取3.0 g腐爛木頭， 無菌操作環境下， 于1L的錐形瓶中， 添加改良后的馬丁氏營養液至500.0 mL， 同時加入一定質量濃度的TCE， 密封后放于25 ℃， 80 r/min振蕩器中馴化培養． 每4 d離心分離菌液， 重復上述操作， 并逐次加大TCE質量濃度， 持續40 d結束．

1.3 培養液

改良的馬丁氏營養液： 2.0 g/L乙酸鈉， 1.0 g/L蛋白胨， 1.0 g/L KH2PO3， 0.5 g/L MgSO4， 0.5 g/L微量元素， 3.0 mL的1%鏈霉素， 3.3 mL的1%孟加拉紅溶液， 加滅菌水定容至1 000.0 mL， 調節pH值為7.0 ± 0.2．

1.4 分析方法

TCE質量濃度由島津氣相色譜 (GC-2010)測定， FID和Rtx-1701 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)分別為檢測器和色譜柱， 保留時間為2.59 min， 具體分析方法見已發表文獻[6]．

1.5 真菌群落結構分析

1.5.1 基因組DNA提取

為分析不同磁場強度下真菌群落結構， 取0.300 0 g生物膜樣品放入2.0 mL滅菌離心管中． 取自反應器底部取樣口， 取樣時間為27 d (MFI0 mT)， 69 d (MFI20.0 mT)， 103 d (MFI60.0 mT)， 137 d (MFI80.0 mT)． 根據說明書提取DNA(OMEGA試劑盒E． Z． N． ATMMag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒)， 使用-80 ℃冰箱保存提取后的DNA．

1.5.2 PCR擴增

提取后的DNA委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行高通量測序． 其中擴增DNA分兩輪完成， 第一輪擴增： 基因組DNA精確定量選用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒． PCR所用的引物已融合了Miseq測序平臺的ITS1-2通用引物； ITS1引物： CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN(barcode)CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA； ITS2-Rev引物： GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGCTGCGTTCTTCATCGATGC． 第二輪擴增引入Illumina橋式PCR兼容引物． 擴增產物再進行DNA純化回收．

1.5.3 高通量測序

回收的DNA使用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒進行精確定量， 按照1∶1等量混合， 等量混合后的DNA樣品量為10 ng， 物質的量為20 pmol． Illumina Miseq 2× 300 bp為上機測序平臺， 原始數據上傳至NCBI數據庫， SRA： 126692．

2 結果與討論

2.1 生物滴濾器的掛膜啟動

啟動階段， TCE的進氣質量濃度控制在24.6～204.6 mg/m3， EBRT為405 s，MFI0 mT， 乙酸鈉為共代謝底物， 每天提供4.5 L營養液， 系統運行溫度25 ℃．

啟動時間為1～15 d， 生物滴濾器對TCE的去除率(Removal Efficiencies， RE)見圖2Ⅰ． 由圖可知隨著啟動時間的延長，RE逐漸增加， 生物膜形成加快． 掛膜第1 d， TCE的質量濃度為24.6 mg/m3，RE為17.17%． 接下來的啟動時間里， 隨著生物膜的快速形成，RE也快速提高． 尤其是第5 d， TCE質量濃度為69.6 mg/m3，RE為95.5%． 為了確定生物膜形成是否成熟， 在6～15 d， 提高TCE進氣質量濃度為86.7～204.6 mg/m3，RE逐漸增大， 在15 d， 穩定在87.8%． 圖3Ⅰ所示此時最大去除容量(Maximum Elimination Capacities， ECmax)為1 630.0 mg/m3h， 對應的進氣負荷(Inlet Loading Rate， ILR)為1 818.4 mg/m3h， 說明生物滴濾器的掛膜啟動階段基本完成． 此結果表明， 以木片為填料的生物滴濾器， 接種已馴化的真菌菌液， 生物滴濾器啟動時間短， 縮短進入穩定運行期的時間．

2.2 磁場強化下對真菌生物滴濾器去除效果影響

16～157 d反應器進入穩定運行期， 依次改變磁場強度：MFI0 mT，MFI20.0 mT，MFI60.0 mT，MFI80.0 mT， 考察對TCE的RE和EC的影響． 共代謝基質仍然為乙酸鈉， 營養液仍為改良后的MDS培養液， EBRT為 405 s； 為考察不同磁場強度下反應器對不同質量濃度TCE的去除效果， TCE的進氣質量濃度設置為： 低質量濃度370 mg/m3， 變質量濃度梯度500～900 mg/m3， 高質量濃度1 000 mg/m3．

2.2.1 生物滴濾器對低進氣質量濃度TCE(370 mg/m3)的去除效果

TCE質量濃度為370 mg/m3， 生物滴濾器對TCE的RE如圖2所示． 由圖可知， 隨著處理時間的延長，RE逐漸增大． 變換磁場大小時，RE開始均較小， 32.3%(MFI20.0 mT)<37.6%(MFI0 mT)<39.2%(MFI80.0mT)<41.8%(MFI60.0mT)， 尤其是MFI20.0 mT， 開始的RE最小， 主要由于磁場剛建立， 有些真菌不適合磁場環境， 生長速度變慢甚至死亡， 而隨著外加磁場時間的延長， 一些真菌逐漸適合磁場環境， 生長速度和產酶量也隨之增大，RE增大， 并達到穩定值． 當磁場強度分別為MFI20.0 mT，MFI60.0 mT，MFI80.0 mT和MFI0 mT， 達到的穩定RE及所需時間分別為： 75.9%， 18 d； 71.4%， 14 d； 67.3%， 14 d； 61.0%， 12 d． 由此可見， 磁場強度越小， 穩定后RE越大，RE最大為75.9%， 此時的MFI為 20.0 mT． 圖3a表示ILR為3 300 g/m3h條件下， 不同磁場強度下的EC圖， 由圖可知， 隨著磁場強化時間的延長，EC逐漸增大，ECmax順序為： 2 548.1 mg/m3h (MFI20.0 mT)>2 412.2 mg/m3h (MFI60.0 mT)>2 318.0 mg/m3h (MFI80.0 mT)>2 038.8 mg/m3h (MFI0 mT)． 此結果說明， 磁場提高對370 mg/m3低質量濃度TCE的去除效果， 尤其是MFI20.0 mT下的去除效果最好．

2.2.2 生物滴濾器對變質量濃度TCE(500～900 mg/m3)的去除效果

工廠排放的廢氣質量濃度多變， 因此， 考察了不同磁場強度下(0 mT， 20.0 mT， 60.0 mT， 80.0 mT)生物滴濾器對變質量濃度TCE的處理效果， 每2 d改變TCE質量濃度(500～900 mg/m3)， 結果如圖2、 圖3所示．

由圖2b可見， 隨著TCE質量濃度的增大，RE呈現降低趨勢．MFI20.0 mT下生物滴濾器對TCE的RE最佳， 維持在67.4%～46.1%， 而當磁場強度增大到60.0，80.0 mT，RE分別在62.8%～41.8%， 58.7%～38.1%． 由此可見隨著磁場強度的增大， 生物滴濾器對TCE的處理效果降低． 而MFI0 mT條件下生物滴濾器對TCE的處理效果最差，RE為56.5%～36.8%． 結果說明， 生物滴濾器外置磁場可以提高對TCE的去除效果， 尤其是低MFI20.0 mT的效果好于MFI60.0 mT和MFI80.0 mT． 圖3b為ILR和EC之間的關系圖，ILR為4 400～8 000 g/m3h． 如圖所示， 當MFI0 mT， 60.0 mT， 80.0 mT，EC隨著ILR的增大而增大， 達到最大值后出現下降趨勢， 主要是由于傳質的限制和反應限制所致[16]． 此外， 高質量濃度TCE也可能引起底物抑制作用， 這也會使高質量濃度下的處理效果降低[16]． 然而MFI20.0 mT時，EC卻隨著ILR的增加而增大， 沒有出現底物抑制作用， 說明低磁場強度可以克服底物抑制作用．ECmax的順序為： 3 684.3 mg/m3h (MFI20.0 mT)>3 425.4 mg/m3h (MFI60.0 mT)>3 289.4 mg/m3h (MFI80.0 mT)>3 138.4 mg/m3h (MFI0 mT)， 對應的ILR分別為7 984.2， 7 162.9， 7 204.7， 7 154.9 mg/m3h．

2.2.3 生物滴濾器對高質量濃度TCE(1 000 mg/m3)的去除效果

高質量濃度TCE具有質量濃度抑制作用， 因此考察高質量濃度(1 000 mg/m3)下不同磁場強度對TCE的去除效果． 如圖2c所示，RE的變化趨勢明顯， 均表現為開始較小， 后隨時間延長， 呈現增大趨勢， 達到最大值．RE大小依次為MFI20.0 mT>MFI60.0 mT>MFI80.0 mT>MFI0 mT． 4種磁場強度下， 開始階段RE均較低， 主要是因為高質量濃度TCE引起溶劑壓力[17]． 開始增大TCE質量濃度， 由于真菌對TCE的去除能力較差， 隨著時間的延長， 溶劑壓力的影響減弱． 尤其是MFI20.0 mT表現較好的RE， 為41.2%～52.9%， 8 d達到最大值． 而MFI60.0 mT和IMF80 mT， 也在8 d達最大RE， 對應的RE范圍稍低， 分別為36.3%～46.6%和32.6%～43.3%． 而無磁場下，MFI0 mT的RE僅為26.8%， 10 d后穩定在39.4%左右． 由此可見， 外置磁場可以減小溶劑壓力， 提高TCE的去除效果． 分析原因： 不同磁場強度下真菌群落結構不同， 導致RE不同； 另外， 不同磁場強度下優勢降解真菌種類也不同， 其對高質量濃度的TCE具有不同的耐受性． 圖3c為EC和ILR的關系圖， 進氣質量濃度為1 000 mg/m3TCE， 對應的進氣負荷為9 000 mg/m3h． 由圖可見， 隨著時間的延長， 4種磁場強度下的EC均呈現增大趨勢，ECmax： 4 854.1 mg/m3h (MFI20.0 mT)>4 168.2 mg/m3h (MFI60.0 mT)>3 975.4 mg/m3h (MFI80.0 mT)>3 594.8 mg/m3h (MFI0 mT)．

Ⅰ： 啟動階段； Ⅱ： MFI 0 mT； Ⅲ： MFI 20.0 mT； Ⅳ： MFI 60.0 mT； Ⅴ： MFI 80.0 mT； a： 370 mg/m3； b： 500～900 mg/m3； c： 1 000 mg/m3．

圖2a，b，c和3a，b，c表明， 外置磁場可以增加生物滴濾器對TCE的去除效果， 不同磁場強度對RE和EC的影響不同． 尤其是低磁場強度處理效果最好，MFI20.0 mT的去除效果好于MFI60.0 mT和MFI80.0 mT， 高磁場強度80.0 mT 對TCE去除效果不明顯． 關于生物滴濾器處理TCE的研究不多， 已報道的接種B.cepaciaG4， 以陶粒為填料， 空床停留時間為8.0～9.8 min， 進氣負荷為ILR0.492 0～1.708 mg/m3h， 所取得的ECmax僅為1 167 mg/m3h[18]． 空床停留時間為202.5 s， 填料為火山石， 降解菌為細菌，MFI60.0 mT，ECmax為2 656.8 mg/m3h， 對應的ILR為4 253.0 mg/m3h[6]． 本研究中， 當MFI20.0 mT，ECmax為4 854.1 mg/m3h， 比已報道的ECmax大．

圖2 進出氣質量濃度與去除率曲線

2.3 磁場強度對真菌群落結構影響

2.3.1 Alpha多樣性指數分析

對樣本聚類后，MFI0 mT，MFI20.0 mT，MFI60.0 mT和MFI80.0 mT的生物膜樣品分別獲得902， 680， 721， 749條OTU． 4個生物膜樣本的覆蓋率均為0.99， 說明本實驗所抽取的序列數足夠可以反映真菌群落的特征．

Chao指數越大， 群落物種數越多， 豐富度越高． 由表1可知， Chao指數MFI80.0 mT>MFI0.0 mT>MFI60.0 mT>MFI20.0 mT． 群落中物種個體數目分配均勻程度用Shannon指數表示， 其均勻度順序為MFI0 mT>MFI80.0 mT>MFI60.0 mT>MFI20.0 mT． 由此說明，MFI20.0 mT作用下的真菌群落物種數最少， 均勻度最小． 分析原因為MFI20.0 mT對某些種類真菌起抑制作用， 導致真菌種類減少， 而對優勢菌具有促進作用， 群落以優勢菌為主， 從而均勻度最小， 由此解釋了MFI20.0 mT下對TCE的去除效果最佳的原因．

表1 生物滴濾器中真菌多樣性

2.3.2 稀疏性曲線

圖4為樣品在0.97相似性水平下的稀釋曲線， 比較說明測序數據量不同的樣本中物種的豐富度． 由圖4可知曲線雖未飽和， 但均趨平坦， 說明樣品均已獲取了絕大多數樣本信息， 可表達樣品中真菌群落組成[19]． 樣本中物種豐富度順序為：MFI0 mT>MFIMFI80.0 mT≈MFI60.0 mT>MFI20.0 mT， 說明無磁場條件下的真菌物種最多， 而MFI20.0 mT作用下的物種數最少．

圖4 生物滴濾器中真菌群落的稀疏曲線

2.3.3 主坐標分析(PCoA)

PCoA表示樣本間差異， 樣品間距越近， 說明群落組成越相似． 圖5說明4個樣本中真菌群落間的差異， 主成分1(PC1)和主成分2(PC2)是樣品的最大2條差異特征， 分別69.2%和18.9%的貢獻率．MFI80.0 mT和MFI60.0 mT的樣品聚在一個格室， 距離較近， 兩者的真菌群落相似性較高．MFI20.0 mT和MFI0 mT分別聚在一個格室， 真菌群落差異較大． 由于主成分1 (PC1)的貢獻率最大為69.2%， 所以MFI20.0 mT和MFI0 mT真菌群落差異最大． 由此可見， 經過磁場強化作用的真菌群落結構與無磁場作用下的差異較大．

圖5 樣本PCoA分析圖

2.4 物種分類水平分析

2.4.1 門水平分析

真菌門分類水平見表2， 表明不同條件下真菌在門水平存在一定差異， 主要門包括Ascomycota， Basidiomycota， Zygomycota， Chytridiomycota， Microsporidia． 磁場強化下優勢門Ascomycota豐度增大， 說明磁場對Ascomycota具有促進作用， 低磁場MFI20.0 mT下的豐度最大． Ascomycota豐度大小順序為MFI20.0 mT(90.82%)>MFI60.0 mT(83.17%)>MFI80.0mT(79.37%)>MFI0 mT(51.67%)．

表2 不同磁場強度下的門水平

本研究結果表明， 優勢門Ascomycota在磁場作用下的豐度明顯增大． Ascomycota門的真菌具有強氧化能力， 可被外源物質利用和降解， 現已廣泛應用于生物修復中： 如有機氯化物、 多環芳烴、 芳香烴類和農藥等[20]． 實驗結果表明， 磁場下TCE去除性提高， 由此說明Ascomycota可以共代謝降解TCE， 磁場作用下增大Ascomycota的豐度， 從而提高磁場作用下對TCE的去除效果． 作為TCE的降解真菌， Ascomycota比其他的降解菌具有更多的優勢， 具有更強的降解能力． 白腐真菌也常用于生物修復中， 但在酸性環境中生長快， 而Ascomycota在中性環境中生長快， 不降解木質素， 不會引起木片填料的降解， 導致壓降[21]． 所以應用Ascomycota為優勢真菌， 構建的真菌生物滴濾器對降解Cl-VOCs具有較好的效果， 具有廣泛的應用前景．

2.4.2 屬水平分析

為了深入地了解真菌的種類和功能， 對排名前10的屬進行了分析(表3)． 由表3可見， 不同磁場條件下真菌群落存在明顯差異． 存在6個主要屬， 分別為Pseudallescheria，Parascedosporium，Exophiala， unclassified Ascomycota， unclassified Sordariomycetes和unclassified Herpotrichiellaceae genera， 功能上可能起到共代謝降解TCE的作用． 6個屬的豐度依次為：MFI20.0 mT (85.9%)>MFI60.0 mT (79.7%)>MFI80.0 mT (63.9%)>MFI0 mT (34.4%)， 該順序與生物滴濾器對TCE的去除效果一致．Pseudallescheria在MFI20.0 mT中的相對豐度最大為22.1%， 而在MFI0 mT中為16.4%， 磁場MFI60.0 mT和MFI80.0 mT中僅為4.8%和3.9%． 由此可見弱磁場有利于提高Pseudallescheria的豐度， 而高磁場強度對其具有抑制作用．Pseudallescheriasp.分布廣泛， 在營養條件差的好氧土壤、 污染的水體、 腐爛的木頭、 糞便和城市污泥中均有分布[ 22]． 研究表明Pseudallescheriasp.可以用于原油[22]、 二噁英、 四氯化到十氯化混合物的二噁英的降解[23]． 通常以葡萄糖為共代謝底物[24]， 真菌生長的最佳pH值小于9， 相比酸性pH值下的白腐真菌具有一定優勢[25]． 因此推測Pseudallescheria提高了MFI20.0 mT下生物滴濾器對TCE的去除效果．

表2和表3說明， 磁場對真菌群落結構存在影響， 通過提高優勢門Ascomycota的豐度， 從而提高對TCE的去除效率， 尤其是弱磁場MFI20.0 mT作用下去除效果最佳． 多數研究表明弱磁場對微生物起促進作用， 而磁場強度增大則起抑制作用． 如安燕等[26]發現由磁粉產生的弱磁場可以加速微生物生長， 1～4 g/L的磁粉有利于微生物對數生長期的提前． Okuno等[27]研究發現低磁場強度促進大腸桿菌生長， 高強度磁場則無此作用． 分析原因為合適大小的磁場磁化了生物膜中的水， 改變了介質水溶液的很多性質， 尤其是介質水溶劑滲透壓的改變提高了微生物細胞膜的通透性， 從而使營養液更容易被微生物吸收， 促進了微生物的生長和繁殖[28]． 另外， 相同磁場強度對不同種微生物的影響也不同， 代群威等[29]研究發現0.15 T磁場對葡萄球菌、 大腸桿菌的生長影響不明顯， 但抑制白色念珠菌生長． 磁場對微生物的影響因素復雜， 隨著磁場大小和類型、 作用時間和溫度、 生長介質、 微生物種類的不同而不同[13]．

表3 不同磁場強度下的屬水平

3 結 論

以木片為填料， 真菌為降解菌， 考察磁場強化下生物滴濾器對TCE廢氣的去除效果． 2.0 g/L乙酸鈉為共代謝底物， EBRT為405 s， 營養液為改良后的馬丁氏營養液， 供給量為4.5 L/d， 主要結論如下： 掛膜啟動階段， TCE進氣質量濃度為24.6～204.6 mg/m3， 磁場強度為0， 在15 d內可快速完成掛膜啟動，RE穩定在87.8%； 磁場提高真菌生物滴濾器對TCE的去除效果， 尤其是MFI20.0 mT下TCE的去除效果最好： TCE質量濃度為370，500～900，1 000 mg/m3，RE和ECmax分別為75.9%， 2 548.1 mg/m3h； 67.4%～46.1%， 3 684.3mg/m3h； 52.9%， 4 854.1 mg/m3h； 磁場作用下降低真菌豐富度和均勻度， 但提高優勢菌的豐度． 優勢門為Ascomycota，MFI20.0 mT中豐度最大為90.82%， 明顯高于MFI0 mT(51.67%)．MFI20.0 mT中的優勢屬為Pseudallescheria， 豐度為22.1%．