酶解玉米芯木聚糖的超聲輔助提取工藝及抗氧化活性

何香凝，劉娜，王園，王瑞芳，安曉萍*，齊景偉*

1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（呼和浩特 010018）；2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)草食家畜飼料工程技術(shù)研究中心（呼和浩特 010018）

我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，玉米是我國主要的糧食作物之一。玉米芯（corn cob）是玉米穗脫去籽粒后的穗軸部分[1]，我國每年玉米的產(chǎn)量可達(dá)1.1億～1.6億 t，而其副產(chǎn)品玉米芯的產(chǎn)量大約可達(dá)2 000萬 t[2]。目前，我國玉米芯主要有四個(gè)方面的用途：一是用作食用菌培養(yǎng)基原料；二是用作燃料；三是用于工業(yè)原料；四是用作生物飼料[3]。大部分玉米芯被作為燃料燃燒，不僅造成資源的浪費(fèi)，同時(shí)還污染環(huán)境。玉米芯因其結(jié)構(gòu)與營養(yǎng)價(jià)值的特殊性，可用于生產(chǎn)木糖醇、糠醛、木糖、低聚木糖、阿拉伯糖和粘結(jié)劑等[2,5-8]。玉米芯具有很多潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，需要進(jìn)一步研究開發(fā)。

纖維素酶是一種能夠水解纖維中β-1, 4-糖苷鍵的酶的總稱，具有協(xié)同作用[9]。纖維素酶可以破壞植物細(xì)胞壁，促進(jìn)動(dòng)物腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收；消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，降低腸道內(nèi)容物的黏度；還可以提高腸道內(nèi)源性消化酶的活性和數(shù)量，改善腸道內(nèi)環(huán)境[10]。纖維素酶在動(dòng)物中普遍應(yīng)用，在單胃動(dòng)物日糧中添加纖維素酶，可以促使動(dòng)物更加充分地吸收利用被包被的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和淀粉等[11]。Upadhaya等[12]在豬的日糧中添加不同劑量的纖維素酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加纖維素酶可明顯提高仔豬的平均日增加質(zhì)量，同時(shí)提高仔豬對飼料的消化率。在反芻動(dòng)物中，纖維素酶可有效降解飼草中的纖維成分，增加飼草料的適口性，提高動(dòng)物采食量，促進(jìn)動(dòng)物對飼草料的吸收利用。采用纖維素酶作用于玉米芯，使玉米芯纖維成分被降解，釋放木聚糖成分。酶解后不僅玉米芯木聚糖的產(chǎn)量提高，同時(shí)還可以有效地改善玉米芯生物活性。

木聚糖（xylan）具有多種生物活性，在食品、保健和醫(yī)藥方面有廣泛應(yīng)用。木聚糖的提取方法多種多樣，常見的有熱水浸提法、微波法、超聲輔助水提、醇提、堿提等方法，試驗(yàn)采用超聲輔助水提，其主要原因是利用超聲輔助具有快速、簡單、高效等特點(diǎn)，近年來超聲輔助提取多糖得到廣泛應(yīng)用[13]。市場上銷售的木聚糖價(jià)格昂貴。由于玉米芯價(jià)格低廉、纖維含量高，因此試驗(yàn)以玉米芯為主要原料，采用纖維素酶對底物進(jìn)行酶解處理，再采用超聲輔助提取玉米芯木聚糖，并對其活性成分進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料玉米芯、玉米粉、豆粕、麩皮（市售，粉碎，過孔徑0.90 mm篩）；腐植酸鈉（市售）；纖維素酶（寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）。

1.1.2 試劑

D-木糖（分析標(biāo)準(zhǔn)品，Aladdin公司）；尿素、葡萄糖（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；鹽酸、氫氧化鈉、3, 5-二硝基水楊酸、四水酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、福林酚、碳酸鈉，硫酸亞鐵、水楊酸鈉、無水乙醇、過氧化氫、DPPH、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸、氯化鐵、六氰合鐵酸鉀、三氯甲烷、正丁醇、三氯乙酸和氯化鐵（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備（見表1）

表1 主要儀器與設(shè)備

1.2 方法

1.2.1 酶解底物的制備

按照一定的配比稱取酶解底物質(zhì)量，將固體底物攪拌均勻，以免加入水后底物攪拌不均勻?qū)γ附庑Ч斐捎绊憽０匆欢ǖ乃媳燃尤胨屠w維素酶，攪拌均勻，用自封袋封口，放入50 ℃高溫培養(yǎng)箱中酶解20 h。

1.2.2 木聚糖的提取與測定

試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[14]。將發(fā)酵的固態(tài)玉米芯烘干后粉碎，取1 g烘干物，加入10 mL蒸餾水于50 mL離心管中，于80 ℃水浴30 min，以5 000 r/min離心15min，取1 mL上清液于10 mL離心管中，加入3 mL鹽酸，沸水浴2 h，冷卻，用氫氧化鈉中和pH至中性，加蒸餾水滴定至刻度線。取1 mL上述液體于10 mL離心管中，加1 mL DNS試劑，沸水浴5 min，繼續(xù)用蒸餾水滴定至刻度，搖勻。取200 μL樣品，用酶標(biāo)儀測定其吸光度。根據(jù)木聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合式計(jì)算其含量。

1.2.3 多酚含量的測定

試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[14]。將發(fā)酵的固態(tài)玉米芯烘干后粉碎，按料液比1：16 g/mL進(jìn)行水提，于90 ℃水浴1 h，冷卻后5 000 r/min離心15 min，取上清液備用。將1 mL上清液與5 mL 10%的福林酚試劑，混合均勻，室溫反應(yīng)3～8 min，加入4 mL 7.5%的碳酸鈉溶液，搖勻后室溫反應(yīng)1 h，在765 nm處測定其吸光度。

1.2.4 黃酮含量的測定

試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[14]。將發(fā)酵的固態(tài)玉米芯烘干后粉碎，按料液比1：20 g/mL進(jìn)行水提，于80 ℃水浴30 min，冷卻后5 000 r/min離心10 min，取上清液備用。準(zhǔn)確移取5 mL上清液，加入0.4 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，反應(yīng)6 min后加入0.4 mL 10%硝酸鋁，搖勻，反應(yīng)6 min后再加入4 mL 4%的氫氧化鈉溶液，放置15 min，加蒸餾水定容到10 mL。在510 nm處測吸光度。

1.2.5 多糖含量的測定

試驗(yàn)方法采用苯酚-硫酸法，參考文獻(xiàn)[15]。料液比為1：16 g/mL，于90 ℃水提35 min，以5 000 r/min離心10 min，取上清液備用。取1 mL上清液加入1 mL蒸餾水，再加入0.5 mL 6%的苯酚溶液和2.5 mL濃硫酸，混勻后冷卻并靜置反應(yīng)20 min。在490 nm處測其吸光度。

1.2.6 還原糖含量的測定

還原糖測定采用顯色法[16]。將料液比按照1：10g/mL，于80 ℃水浴30 min，再以5 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，加入1 mL DNS顯色劑，沸水浴5 min后冷卻，稀釋至10 mL，在520 nm處測吸光度。

1.2.7 木聚糖體外抗氧化活性測定

1.2.7.1 DPPH自由基的清除能力

試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[17]。將超聲輔助提取前后的酶解玉米芯木聚糖粉末分別配制成質(zhì)量濃度0.5，1，2和4 mg/mL的溶液。取2 mL不同濃度的木聚糖溶液，加入2 mL DPPH試劑，混勻后室溫反應(yīng)30 min。在517 nm處測吸光度，記為A0。將乙醇代替DPPH測得的吸光度記為A1，將蒸餾水代替樣品測得的吸光度記為A2。

1.2.7.2 羥自由基的清除能力

試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[17]。將超聲輔助提取前后的酶解玉米芯木聚糖粉末分別配制成質(zhì)量濃度0.5，1，2和4 mg/mL的溶液。取0.5 mL樣品溶液加入0.5 mL 9 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，再加入0.5 mL 8.8 mmol/L的過氧化氫溶液，室溫反應(yīng)10 min。后再加入0.5 mL 9 mol/L的水楊酸乙醇溶液，室溫反應(yīng)30 min，在510 nm處測吸光度，OD值記為A1。將蒸餾水代替樣品的吸光度記為A0。將蒸餾水代替硫酸亞鐵溶液的吸光度記為A2。

1.2.7.3 還原力

試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[17]。將超聲輔助提取前后的酶解玉米芯木聚糖粉末分別配制成質(zhì)量濃度0.5，1，2和4 mg/mL的溶液。取0.75 mL的木聚糖溶液加入0.75 mL 200 mmol/L pH 6.6的磷酸緩沖液，再加入0.75 mL 1%的六氰合鐵酸鉀溶液，混勻后50 ℃反應(yīng)20 min。再加入0.75 mL 10%的三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。將上述混合溶液于3 000 r/min離心10 min（若無沉淀則不離心）。取1.5 mL上述上清液，加入1.5 mL蒸餾水和400 μL 0.1%氯化鐵溶液，室溫反應(yīng)10 min。在700 nm處測吸光度，記為A0，將蒸餾水代替樣品測得的吸光度記為A1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 超聲功率對酶解玉米芯中木聚糖產(chǎn)量的影響

將超聲功率設(shè)置為300，350，400和450 W，料液比為1：20 g/mL，超聲時(shí)間為30 min，超聲溫度為80℃，對其進(jìn)行超聲輔助水提，測定其木聚糖產(chǎn)量。

1.3.2 超聲溫度對酶解玉米芯中木聚糖產(chǎn)量的影響

將超聲溫度設(shè)置為50，60，70，80和90 ℃，料液比為1：20 g/mL，超聲時(shí)間為30 min，功率為400 W，對其進(jìn)行超聲輔助水提，測定其木聚糖產(chǎn)量。

1.3.3 超聲時(shí)間對酶解玉米芯中木聚糖產(chǎn)量的影響

將超聲時(shí)間分別設(shè)置為20，30，40，50和60 min，料液比為1：20 g/mL，超聲溫度為70 ℃，功率為400W，對其進(jìn)行超聲輔助水提，測定其木聚糖產(chǎn)量。

1.3.4 料液比對超聲輔助水提玉米芯中木聚糖產(chǎn)量的影響

將料液比分別設(shè)置為1：10，1：15，1：20，1：25和1：30 g/mL，超聲時(shí)間為50 min，溫度為70 ℃，超聲功率為400 W，對其進(jìn)行超聲輔助水提，測定其木聚糖產(chǎn)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)均設(shè)置5個(gè)重復(fù)，采用SAS 9.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，p＜0.05表示差異顯著。采用Origin軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲功率對酶解玉米芯中木聚糖產(chǎn)量的影響

從圖1可以看出，當(dāng)超聲功率由300 W升高到400 W時(shí)，木聚糖產(chǎn)量顯著升高；當(dāng)超聲功率達(dá)到400 W時(shí)，木聚糖產(chǎn)量最高，為（203.12±1.68）mg/g；當(dāng)超聲功率超過400 W時(shí)，木聚糖產(chǎn)量反而下降。因此，最佳的超聲功率為400 W。

圖1 超聲功率對酶解玉米芯中木聚糖產(chǎn)量的影響

2.2 超聲溫度對酶解玉米芯中木聚糖產(chǎn)量的影響

從圖2可以看出，當(dāng)超聲溫度由50 ℃升高到70 ℃時(shí)，隨著提取溫度的升高，木聚糖產(chǎn)量越高；當(dāng)超聲溫度超過70 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，木聚糖產(chǎn)量下降；當(dāng)超聲溫度為70 ℃時(shí)，木聚糖產(chǎn)量最高，為（220.48±0.41）mg/g。因此，超聲最佳溫度為70 ℃。

圖2 超聲溫度對酶解玉米芯中木聚糖產(chǎn)量的影響

2.3 超聲時(shí)間對酶解玉米芯中木聚糖產(chǎn)量的影響

從圖3可以看出，在超聲輔助提取玉米芯木聚糖的過程中，在超聲50 min以前，隨著超聲時(shí)間的延長，木聚糖產(chǎn)量增加，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)，木聚糖產(chǎn)量最高，為（233.26±0.22）mg/g。隨后，隨著超聲時(shí)間的增加，木聚糖產(chǎn)量反而降低。因此，最適的超聲時(shí)間為50 min。

圖3 超聲時(shí)間對酶解玉米芯中木聚糖產(chǎn)量的影響

2.4 料液比對超聲提取酶解玉米芯中木聚糖產(chǎn)量的影響

從圖4可以看出，在超聲輔助水提酶解玉米芯木聚糖的過程中，隨著料液比的增加木聚糖含量也隨之增加，當(dāng)料液比達(dá)到1：25 g/mL時(shí)，木聚糖含量達(dá)到最高，為（247.87±3.93）mg/g。隨后，當(dāng)料液比超過1：25 g/mL時(shí)，隨著料液比的增加，木聚糖含量反而降低。因此，在超聲提取過程中最佳的料液比為1：25 g/mL。

圖4 料液比對酶解玉米芯中木聚糖產(chǎn)量的影響

2.5 超聲提取前后酶解玉米芯中活性成分對比分析

從表2可以看出，超聲提取后酶解玉米芯中多糖、還原糖、木聚糖、多酚和黃酮等活性成分均顯著高于超聲提取前（p＜0.05）。由此說明，超聲輔助提取可以提高玉米芯中活性成分的含量。

表2 超聲提取前后酶解玉米芯中活性成分對比單位：mg/g

2.6 體外抗氧化活性分析

2.6.1 DPPH自由基清除能力

從圖5可以看出，隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，各試驗(yàn)品對DPPH自由基清除能力逐漸增強(qiáng)。在試驗(yàn)過程中，以VC和BHA作為對照品，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0～2 mg/mL時(shí)，對照品對DPPH自由基的清除率均較試驗(yàn)品高；當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為2～4 mg/mL時(shí)，超聲輔助提取法制備的玉米芯木聚糖成分對DPPH自由基的清除率較BHA的效果好。在各質(zhì)量濃度條件下超聲輔助提取法制備的玉米芯木聚糖對DPPH自由基的清除率的效果均優(yōu)于單獨(dú)使用熱水浸提制備的玉米芯木聚糖，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)77.93%±1.39%，該樣品的效果接近于BHA的效果。

2.6.2 羥自由基清除能力

從圖6可以看出，隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，各試驗(yàn)品對羥自由基清除能力逐漸增強(qiáng)。在試驗(yàn)過程中，以VC和BHA作為對照品，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為4mg/mL時(shí)，試驗(yàn)品對羥自由基的清除率高于BHA的效果，且此時(shí)超聲輔助提取法制備的玉米芯木聚糖對羥自由基的清除率達(dá)61.44%±0.16%，效果與單獨(dú)采用熱水浸提法制備的效果差異不顯著（p＞0.05）。

圖5 木聚糖對DPPH自由基清除率的影響

2.6.3 還原力測定

從圖7可以看出，隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，其還原力顯著提高（p＜0.05）。在試驗(yàn)過程中，以VC和BHA作為對照品，在各質(zhì)量濃度條件下，對照品的還原力效果均較試驗(yàn)品好，同時(shí)超聲輔助提取法制備的玉米芯木聚糖成分的還原力優(yōu)于單獨(dú)使用熱水浸提法制備的玉米芯木聚糖成分的還原力。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，還原力達(dá)0.92±0.002，此時(shí)超聲輔助法制備的玉米芯木聚糖的還原力效果接近于BHA的效果。

圖6 木聚糖對羥自由基清除率的影響

圖7 木聚糖對還原力的影響

3 討論與結(jié)論

從超聲輔助提取條件的篩選過程可以看出，最適的超聲功率為400 W，在超聲提取過程中，隨著超聲功率的增加，木聚糖產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，其可能原因是當(dāng)超聲功率增大時(shí)，可加速破壞細(xì)胞壁，進(jìn)而使木聚糖成分充分釋放；當(dāng)超過一定功率時(shí)，空間效應(yīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，再繼續(xù)增加超聲功率會(huì)使聲波發(fā)生散射或者減弱，因此木聚糖產(chǎn)量下降，該試驗(yàn)結(jié)果與倪玉潔等[18]、王涓等[19]研究結(jié)果的變化趨勢相一致。還有可能是超聲功率過大，使木聚糖分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而使木聚糖產(chǎn)量下降。超聲溫度對木聚糖產(chǎn)量的影響與超聲功率變化結(jié)果相同。當(dāng)溫度為50～70 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，木聚糖產(chǎn)量增加，可能的原因是隨著溫度的升高，木聚糖的溶解率逐漸增加，當(dāng)溫度超過70 ℃時(shí)，木聚糖產(chǎn)量反而下降，可能是由于溫度過高，使木聚糖成分發(fā)生改變，從而使木聚糖產(chǎn)量下降[18]。在超聲輔助提取酶解玉米芯木聚糖的過程中，在提取20～50 min時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，超聲作用使木聚糖的溶出率增加，從而使木聚糖產(chǎn)量增加；隨后，當(dāng)提取時(shí)間超過50 min時(shí)，木聚糖產(chǎn)量下降，可能是由于隨著超聲時(shí)間的增加，超聲波提供的能量變大，使已經(jīng)提取出來的使木聚糖成分發(fā)生破壞，從而使木聚糖最終產(chǎn)量下降[20]。對于料液比而言，木聚糖產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，可能的原因是在超聲提取前期，隨著溶劑的增多，加之超聲作用，酶解玉米芯與水充分接觸，使木聚糖成分得到充分釋放，而水量較多會(huì)阻止超聲波對酶解玉米芯細(xì)胞壁的破壞，使木聚糖成分釋放受阻，從而降低其得率[18]。此外，當(dāng)料液比大于1：25 g/mL時(shí)，木聚糖產(chǎn)量下降還可能是由于當(dāng)含水量達(dá)到某種程度再繼續(xù)增加時(shí)，玉米芯木聚糖被稀釋[21]。因此，通過上述超聲提取條件的篩選可以得出：在功率400 W、溫度70 ℃、時(shí)間50 min，料液比1：25 g/mL的條件下，酶解玉米芯木聚糖的產(chǎn)量為（247.87±3.93）mg/g。

經(jīng)超聲輔助提取后其產(chǎn)物中的多糖、還原糖、木聚糖、多酚和黃酮等成分均較超聲前顯著提高，其可能的原因是經(jīng)過超聲波作用后，其有效成分均得到充分釋放。

抗氧化結(jié)果表明，超聲輔助提取的酶解玉米芯木聚糖對羥自由基清除率、DPPH自由基清除率以及還原力均較超聲提取前的效果好，尤其在低濃度條件下，樣品質(zhì)量濃度與體外抗氧化活性呈一定線性關(guān)系，當(dāng)濃度達(dá)到一定程度時(shí)，其清除率與還原力不再升高，超聲輔助提取的酶解玉米芯木聚糖對羥自由基的清除率為61.44%±0.16%，其對DPPH自由基的清除率達(dá)到77.93%±1.39%，還原力達(dá)0.92±0.002。這可能是由于樣品中含有其他雜質(zhì)成分，樣品中的雜質(zhì)成分絕對含量達(dá)到一定程度，使反應(yīng)體系發(fā)生鈍化[22]。在三種體外抗氧化指標(biāo)測定結(jié)果中，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，超聲輔助提取的酶解玉米芯木聚糖成分的效果均接近于標(biāo)準(zhǔn)品BHA的效果。由此說明，超聲輔助提取的酶解玉米芯木聚糖具有一定的體外抗氧化活性。