基于響應面法的雜糧粉酶解工藝優化

馬麗媛，李楊*，尚爾坤，張雅娜，郭麗

1. 綏化學院食品與制藥工程學院（綏化 152061）；2. 綏化市食品藥品檢驗檢測所（綏化 152000）

人們習慣上把除水稻、小麥、玉米、大豆和薯類五大作物以外的糧豆作物稱為雜糧。雜糧粉是將雜糧經過精細研磨成粉末，可直接或做成多種面類食品供人食用的一種食品。利用科學的配方和精細的加工制成的雜糧粉，不僅營養成分豐富，而且口感更有層次，吸收更快，補充能量更迅速，更抗饑餓[1]。

在我國，生產雜糧粉的加工技術還是較為傳統單一的滾筒干燥技術和擠壓膨化技術[2]。傳統工藝設備簡單、易操作，但雜糧粉沖調不均、易結塊、黏度大、不易吞咽。嬰幼兒腸道內缺少淀粉水解酶，食用雜糧粉后常有脹氣、腹瀉等問題。袁海娜等[3]在研究嬰幼兒谷基配方米粉時，將粳米制成米粉，加入α-淀粉酶，經水解后的米粉黏度降低，更易沖調且不易結塊，使嬰幼兒更易吞咽、消化和吸收。公麗艷等[4]以6種雜糧為原料制成的雜糧粉，不僅口感有了整體的提升，還提高了雜糧粉的糊化度及復水性。淀粉在酶的作用下水解成小分子，使淀粉的吸收速率加快[5]。Fronetla等[6]將萌芽稻米做成米粉，檢測后發現稻米中的可溶性糖、維生素、可溶性蛋白質的含量較未萌發的稻米中的含量高出很多，這是由于萌發過程中酶的催化作用引起的。

開發雜糧粉具有重要的食用價值和可觀的經濟價值。目前，市面上的雜糧粉多以大米為主料，此次試驗以小米、玉米、薏米、綠豆、燕麥為原料，利用復合酶進行水解制作雜糧粉，無論是從營養、口感還是沖調等方面，都將優于傳統工藝生產的雜糧粉，為雜糧粉的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設備

1.1.1 材料與試劑

小米、玉米、薏米、綠豆、燕麥（市售，挑選粒大飽滿，籽粒圓潤、無蟲害、無霉變的優質谷物雜糧）。α-中溫淀粉酶（酶活力≥2 000 U/g，無錫市雪梅酶制劑科技有限公司）；纖維素酶（酶活力10萬 U/g，和氏璧生物技術有限公司）；淀粉葡萄糖苷酶（酶活力≥10萬 U/g，北京華邁科生物技術有限責任公司）；中性蛋白酶（酶活力≥6萬 U/g，北京奧博星生物技術有限責任公司）；碘化鉀、乙酸鋅、亞硝酸鈉（天津市致遠化學試劑有限公司）；氫氧化鈉、硫酸銅、葡萄糖（天津市濱海科迪化學試劑有限公司）；亞鐵氰化鉀（天津市瑞金特化學試劑有限公司）；冰乙酸（天津市光復科技發展有限公司）。

1.1.2 儀器與設備

CF-100KS型萬能粉碎機（廣州晨雕機械設備有限公司）；HH-6型數顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市萊華儀器制造有限公司）；XS 365M型天平（瑞士普里賽斯儀器有限公司）；101-3AB型電熱恒溫鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；JYC-21ES55C型電磁爐（杭州九陽生活電器有限公司）。

1.2 工藝流程

雜糧除雜→粉碎→過孔徑0.200 mm篩網→混合→雜糧粉溶液→滅酶→調溫→加酶酶解→滅酶→冷卻→過濾→測DE值

↘濾渣烘干→稱其質量

1.3 操作要點

1) 雜糧除雜：將小米、玉米、薏米、綠豆、燕麥中的雜質（石子、雜草等）剔除，防止雜質污染產品或對試驗結果造成誤差。

2) 粉碎：將除雜后的雜糧用萬能粉碎機粉碎成粉。為避免過熱，出現焦粉現象，應采用間歇粉碎法，即一次性磨粉30 s，間歇1 min。

3) 過篩：將所磨雜糧粉末過孔徑0.200 mm篩，備用。

4) 混合：按1：1：1：1：1質量比取上述5種雜糧粉，按底物濃度5%加水調漿，不斷攪拌，使雜糧粉與水混合均勻。

5) 滅酶：于90 ℃滅酶10 min（使雜糧本身的酶失活）。

6) 調溫：將加熱后的雜糧漿液冷卻至酶解適宜的溫度，備用。

7) 加酶酶解：將試驗所需的酶按要求加入到預熱的雜糧溶液中，酶解一定時間。

8) 滅酶：酶解結束后溫度升至90 ℃滅酶10 min（使加入的酶失活），取出冷卻至室溫。

9) 過濾：將冷卻的雜糧粉漿液用八層紗布過濾，濾液用來測DE值。

10) 烘干：將過濾后的濾渣烘干，稱其質量。

1.4 DE值的測定方法

用DE值（還原糖含量，Dextrose Equivalent）來表示淀粉的糖化程度，酶解后的漿液還原糖含量越高，則它的DE值越高，表示淀粉水解得越徹底。試驗中還原糖含量測定參照GB/T 5009.7—2016[7]直接滴定法進行測定。

2 結果與分析

2.1 最適酶的確定

由圖1可知，α-中溫淀粉酶和中性蛋白酶的DE值最高，分別為21.9%和17.0%，中性蛋白酶水解植物性蛋白質的效果較其他的蛋白酶更明顯，水解谷物類的蛋白會生成分子質量很小但活性很高的短肽分子[8]。黃佩佩[9]的研究指出，在雜糧谷物中淀粉和蛋白質的含量最高，其中淀粉含量在70%左右，蛋白質含量在8%～18%左右，所以中性蛋白酶和α-中溫淀粉酶在酶解過程中發揮的作用最大。參考王富盛等[10]多酶復合對玉米粉質構特性的影響，選擇效果最佳的兩種酶進行1：1復配，這樣可增加酶催化位點，可使反應更加快速高效。

圖1 不同種類的酶對雜糧粉酶解效果的影響

2.2 α-中溫淀粉酶與中性蛋白酶復配比的確定

由圖2可知，將α-中溫淀粉酶和中性蛋白酶進行不同質量比復配后，DE值表現出先上升后下降的趨勢。質量比在3：7～6：4之間，隨著α-中溫淀粉酶的增加，DE值呈現緩慢上升趨勢；在6：4條件下DE值達到最大，為21.9%；隨著α-中溫淀粉酶持續增加，DE值呈下降趨勢。由于α-中溫淀粉酶含量過高，會抑制中性蛋白酶的活性，影響酶解效率，從而導致DE值呈下降趨勢。此結果與陸東和等[11]在嬰幼兒米粉復合酶解技術研究中所研究的α-中溫淀粉酶與中性淀粉酶質量比6：4的情況基本相似。

圖2 酶復配質量比對雜糧粉酶解的影響

2.3 酶解時間的確定

酶解時間也是雜糧粉酶解的一個重要參數。由圖3可知，當酶解時間在30～120 min之間時，DE值呈上升趨勢；當酶解時間在120～150 min之間時，DE值呈現下降趨勢，且DE值下降趨勢明顯。當酶解時間為120 min時，雜糧粉的DE值最高，為23.6%。DE值之所以出現這樣變化的原因是隨著時間的增加，酶解反應不斷進行，底物由于被酶解，底物含量由多變少，酶解效果隨之變弱，導致DE值變低[12]。陸東和等[11]在嬰幼兒米粉復合酶解技術研究中發現，酶解反應隨著時間的推移，達到了最佳酶解效果后逐漸變得緩慢，這與此次試驗的雜糧粉最佳酶解時間一致。

圖3 時間對雜糧粉酶解效果的影響

2.4 酶添加量的確定

酶添加量對雜糧粉的酶解程度影響顯著。由圖4可知，當酶添加量在0.05%～0.10%之間時，DE值呈顯著上升趨勢；繼續增加酶添加量，DE值呈現下降趨勢；當酶添加量為0.10%時，雜糧粉的DE值最高，為22.7%。在一定范圍內，酶添加量越高，DE值越高，這是因為酶添加量相對于底物不充足時，隨著酶添加量的增加，反應速率隨之增加，所以DE值呈現上升趨勢；當酶添加量持續增加，而底物濃度相對不足時，反應速率會減慢，DE值的上升速率也會變慢甚至出現下降趨勢。張春曉[13]在小米粉制備技術研究中結果顯示，酶添加量在一定范圍內增加時，DE值逐漸增高，當酶添加量達到某一值時，DE值達到最高后出現下降趨勢，這與此次試驗的結果基本一致。

圖4 不同酶添加量對雜糧粉酶解的影響

2.5 酶解溫度的確定

溫度對雜糧粉酶解的影響較大。由圖5可知，當溫度在45～50 ℃之間時，DE值呈現上升趨勢；當溫度在50～65 ℃之間時，DE值呈現下降趨勢；當溫度為50 ℃時，DE值最大，為22.7%。這是因為當溫度較低時，酶活力較低，反應不充分，所以DE值較低，隨著溫度的升高，反應物能量增加，單位時間內有效碰撞次數增加，反應速率加快，所以DE值升高；另外，由于酶的本質是蛋白質，隨著溫度的升高，在超過酶的最適溫度后，酶蛋白會逐漸變性失活，從而導致酶促反應速度下降[12]。王富盛等[10]在多酶復合對玉米粉質構特性的影響中指出，中性蛋白酶的最適溫度為50 ℃，金靜等[14]在酶處理對小米粉黏度的影響中研究發現，α-中溫淀粉酶最適溫度為50 ℃，與此次試驗的結果一致。

圖5 溫度對雜糧粉酶解的影響

2.6 響應面優化試驗

在單因素試驗基礎上，選取酶解溫度、酶解時間、酶添加量3個因素開展Box-Behnken中心組合設計試驗，因子編碼值及試驗結果見表1。

表1 響應面設計及結果

運用Design Expert軟件對表1中17個響應值進行回歸擬合，得到二次多項回歸模型方程：Y=25.36-0.11A-0.087B-0.17C+0.27AB-0.45AC+0.100BC-1.17A2-0.22B2-1.34C2。同時對上述回歸模型進行方差分析，結果如表2所示。

表2結果顯示：模型極顯著，矯正系數R2=0.993 0，說明99.3%的響應值變化能通過該模型解釋；同時失擬項不顯著，說明可用建立的模型對雜糧粉的DE值進行分析和預測。另外，一次項B、二次項BC對雜糧粉DE值影響顯著，一次項A、C，二次項AC、AB對雜糧粉DE值影響極顯著。各因素間的交互作用響應曲面圖見圖6。

表2 響應面二次模型及回歸系數的方差分析結果

圖6 還原糖含量（DE值）的響應曲面圖

通過圖6可看出各單因素之間交互作用對響應值的影響程度，響應面越陡，表明該因素對響應值影響越顯著[15]。結合方程各項的系數項進行分析，試驗中各因素及各因素間交互作用對雜糧粉酶解效果的影響程度依次為AC（酶解溫度和酶添加量）＞AB（酶解溫度和酶解時間）＞C（酶添加量）＞A（酶解溫度）＞BC（酶解時間和酶添加量）＞B（酶解時間）。

2.7 驗證試驗

經回歸方程計算，雜糧粉酶解的最佳工藝參數為酶解溫度49.67 ℃、酶解時間為112.29 min、酶添加量0.10%。考慮到實際操作可行性，將工藝參數調整為酶解溫度50 ℃、酶解時間為112 min、酶添加量0.10%。在此工藝參數下進行3次平行驗證試驗，雜糧粉酶解后的DE值分別為25.1%，24.9%和25.3%，其平均值為25.1%，與模型預測25.4%基本相符。

3 結論

采用Box-Behnken響應面法對雜糧粉酶解工藝條件進行優化，軟件優化后的DE值為25.4%，而實測值為25.1%，與預測值相差不大，該模型極顯著（p＜0.000 1），矯正系數較高（R2=0.993 0），證明模型的可靠性及試驗誤差較小。響應面法優化的雜糧粉最佳酶解條件為酶解溫度50 ℃、酶解時間112 min、酶添加量0.10%，在α-中溫淀粉酶與中性蛋白酶質量比為6：4時，雜糧粉的DE值達到最高值，為25.1%。雜糧營養豐富，加工成各種食品成本較低，且受眾面廣，擁有廣闊市場需求和發展前景。研究更易消化吸收、營養成分更全、配方更科學的雜糧粉產品具有重要意義，能夠促進雜糧粉產業迅速發展。