大孔樹脂純化縱條紋炭角菌中環肽Xylastriamide A工藝

任志洋，唐凡淋，袁小紅*

西南科技大學生命科學與工程學院（綿陽 621000）

縱條紋炭角菌（Xylaria striataPat. 1887）為子囊菌門（Ascomycota）炭角菌科（Xylariaceae）炭角菌屬（XylariaHill ex Schrank）真菌，生長范圍主要在腐朽樹皮和活樹根上[1]。前期對縱條紋炭角菌進行多年研究，包括縱條紋炭角菌子實體的培養[1]、液體培養優化[2-3]、子實體化學成分研究[4]及抗菌活性方案[5]、抗腫瘤活性[6]等，為縱條紋炭角菌的開發利用提供基礎。從炭角菌屬真菌的菌絲體中分離得到多種新穎的化合物，且證明其具有良好的生物活性[7]。環肽物質因其特殊的結構和構象關系[8]而具有較好的抗腫瘤、抗癌活性[9]，其在新藥開發中得到了極大的重視。雷傳文[10]運用多種色譜技術從縱條紋炭角菌中分離得到一種新的環肽Xylastriamide A，其作為一種新穎的環肽類物質，發現具有顯著的抗腫瘤活性，并且對秀麗隱桿線蟲也有一定的抗蟲活性，表明該環肽有著極大的研究價值和應用前景。

該類化合物傳統的分離方法[11]是通過一系列的色譜技術進行純化，從而獲得單體物質，該法步驟多且效率低，會耗費大量的溶劑和時間，且固相吸附嚴重。為更好地對環肽Xylastriamide A進行研究開發，有必要改良該環肽的分離純化過程，從而為該環肽的進一步分析提供基礎保障。大孔吸附樹脂因其吸附效果好，操作簡便，可反復使用的特性，被廣泛運用于中藥材的有效成分富集及分離純化工藝中[12-13]。為很好地對環肽Xylastriamide A進行分離，試驗以縱條紋炭角菌為材料，采用不同型號、性能的樹脂對縱條紋炭角菌環肽進行吸附、解吸試驗，篩選出最適宜分離該環肽的樹脂，并對縱條紋炭角菌環肽分離純化條件進行優化，以達到對環肽富集的效果，為縱條紋炭角菌的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

縱條紋炭角菌（2012年7月由賀新生教授采于西南科技大學楊樹樁，鑒定為炭角菌科炭角菌屬縱條紋炭角菌Xylaria striataPat. 1887）。

鹽酸（分析純）；氫氧化鈉（分析純）；無水乙醇（分析純）；乙腈（色譜純）；超純水。

根據環肽Xylastriamide A的極性，故選擇不同型號的大孔樹脂來進行后續研究。

表1 不同型號的大孔吸附樹脂參數

1.1.2 儀器與設備

XJ-2小型提取濃縮機組（天津大明制藥設備廠）；高效液相色譜儀（Agilent Technologies 1260Infinity）；色譜柱（Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）；SHB-Ⅲ 循環水式多用真空泵；Rotavapor R-210旋轉蒸發儀。

1.2 方法

1.2.1 縱條紋炭角菌粗提液制備

取縱條紋炭角菌子實體，粉碎過孔徑0.425 mm篩，按料液比1︰5（g/mL）加入90%乙醇在70 ℃下浸提3次，每次2 h，合并濾液，旋轉蒸發濃縮至浸膏后，加入蒸餾水溶解，得到縱條紋炭角菌粗提液。

1.2.2 縱條紋炭角菌中環肽Xylastriamide A含量測定

采用HPLC法，準確稱取1 mg縱條紋炭角菌環肽Xylastriamide A標準品，用乙腈將其溶解，配成一系列的質量濃度梯度溶液。按照流動相采用乙腈-水（65︰35），流速1.0 mL/min，檢測波長216 nm，進樣量20 μL，柱溫35 ℃，等度洗脫的方式，在該條件下測定目標物峰面積，以峰面積（Y）和環肽質量濃度（X）作圖，得標準回歸曲線方程為Y=32.789X+2.198 6（R2=0.999 6），線性關系良好。

1.2.3 大孔樹脂預處理[14]

將新購買的大孔樹脂（H103、HP20、D101、AB-8）用無水乙醇浸泡過夜，使其充分溶脹，再濕法裝柱，用乙醇洗至流出液不渾濁為止，用蒸餾水沖洗至無醇味。依次酸洗，用2 BV的5%鹽酸溶液浸泡4 h，用蒸餾水洗至中性；堿洗，用2 BV的2%氫氧化鈉溶液浸泡4 h，用蒸餾水洗至中性。備用。

1.2.4 大孔樹脂篩選

分別取預處理好的不同類型的大孔樹脂（AB-8、D101、HP20、H103）適量，用濾紙吸干水分后，各自稱取1 g于100 mL錐形瓶中，加入20 mL的縱條紋炭角菌粗提物，置于搖床中（25 ℃，120 r/min）靜態吸附24 h。各自取一定量上清液測定環肽Xylastriamide A濃度，按式（1）計算出各樹脂對該環肽的吸附率。將大孔樹脂取出，用濾紙吸干表面提取液，加入100%乙醇20 mL進行靜態解析，解吸液經HPLC測定環肽含量并按式（2）計算各樹脂對該環肽的解析率。

式中：E1為樹脂的吸附率，%；C0為吸附液中環肽的初始質量濃度，mg/mL；C1為吸附后剩余的環肽質量濃度，mg/mL。

式中：E2為樹脂解吸率，%，C0為吸附液中環肽初始質量濃度，mg/mL；C1為吸附后剩余環肽質量濃度，mg/mL；C2為解吸液中環肽質量濃度，mg/mL；V1為吸附液體積，mL；V2為解吸液體積，mL。

1.2.5 大孔樹脂靜態吸附研究

取處理好的D101樹脂，用濾紙吸干水分，稱取1 g于100 mL錐形瓶中，加入20 mL的縱條紋炭角菌提取液，置于搖床中（25 ℃，120 r/min）靜態吸附24 h，并分別在1，2，3，4，6，8和12 h取樣進行HPLC檢測，測定環肽Xylastriamide A含量，按式（3）測量吸附量，作吸附量-時間圖。

式中：Qc為樹脂的吸附量，mg/g；C0為吸附液中環肽的初始質量濃度，mg/mL；C1為吸附后剩余的環肽質量濃度，mg/mL；V1為吸附液體積，mL；M為樹脂質量，g。

1.2.6 大孔樹脂對該環肽的動態吸附條件優化[15]

1.2.6.1 不同上樣流速對大孔樹脂吸附效果的影響

取100 mL質量濃度3 mg/mL的縱條紋炭角菌提取液，改變上樣流速進行動態吸附，柱體積（BV）為30mL，分別以1，2，3，4和5 BV/h的流速上柱吸附，收集流出液，計算吸附率。作吸附率-流速圖。

1.2.6.2 不同上樣濃度對大孔樹脂吸附效果的影響

取4份3 mL質量濃度100 mg/mL的縱條紋炭角菌提取液，分別加入297，97，57和39.8 mL用水制成1，3，5和7 mg/mL的混懸液，柱體積（BV）30 mL，流速2 BV/h，以不同質量濃度上柱吸附，收集流出液，計算吸附率。作吸附率-質量濃度圖。

1.2.6.3 不同上樣量對大孔樹脂吸附效果的影響

取質量濃度3 mg/mL的縱條紋炭角菌提取液，以2 BV/h的吸附流速上柱，每處理1 BV樣液（1 BV=30 mL）的流出液單獨收集，測定流出液中的環肽Xylastriamide A濃度。流出液中該環肽質量濃度達到上樣液質量濃度的10%時，確定樹脂的吸附已達到飽和[16]。作流出液質量濃度-流出液體積圖。

1.2.7 大孔樹脂對該環肽的動態解吸條件優化

1.2.7.1 不同體積分數乙醇對大孔樹脂解吸條件的影響

取質量濃度3 mg/mL的縱條紋炭角菌提取液7 BV（5份），分別以2 BV/h上柱吸附，收集流出液，計算吸附量，用3 BV的40%乙醇解吸，測定流出液中環肽Xylastriamide A含量，分別用60%，70%，80%，90%和100%乙醇溶液進行解吸，解吸流速為2 BV/h，收集解吸液，測定環肽Xylastriamide A濃度，計算解析率，比較不同體積分數解吸劑對大孔樹脂解吸效果的影響。

1.2.7.2 洗脫劑量對大孔樹脂解吸條件的影響

取質量濃度3 mg/mL的縱條紋炭角菌提取液7 BV，以2 BV/h上柱吸附，收集流出液，計算吸附量，用3 BV的40%乙醇洗去雜質，用100%乙醇溶液進行洗脫，每1 BV單獨收集，測定環肽Xylastriamide A濃度。作流出液質量濃度-洗脫液量體積圖。

1.2.8 純化工藝驗證

取質量濃度3 mg/mL的縱條紋炭角菌提取液7 BV，以2 BV/h上柱吸附，收集流出液，計算吸附量，用3BV的40%乙醇洗去雜質，用3 BV的100%乙醇溶液進行解吸。平行操作3次，按最佳工藝條件，通過HPLC分析大孔樹脂處理前后環肽Xylastriamide A占比。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

由表2可以看出，4種大孔吸附樹脂對縱條紋炭角菌中環肽的吸附和解吸效果不同。在這4種大孔樹脂中，HP20、D101、AB-8均對縱條紋炭角菌中環肽有著較好的吸附率和解析率，但D101的吸附率最大，解析率適中，且D101更加適合工業生產使用，因此，綜合考慮，選用D101作為純化縱條紋炭角菌中環肽的最佳樹脂。

表2 不同型號的大孔吸附樹脂篩選

2.2 大孔樹脂靜態吸附動力學曲線

由圖1可以看出，D101大孔樹脂在0～4 h之間，吸附量隨著時間延長呈現急劇增加趨勢，為快速吸附階段；在4～6 h之間，吸附量增加不明顯，為慢速吸附階段；6 h以后，吸附量的變化不大，樹脂的吸附已經接近飽和。故在實際應用中，綜合考慮生產周期、效率等因素，上柱液靜態吸附最佳時間為6 h。

2.3 大孔樹脂對該環肽的動態吸附條件優化

2.3.1 不同上樣流速對大孔樹脂吸附效果的影響

由圖2可知，隨著上樣流速增加，環肽的吸附率不斷降低。可能是上樣流速較慢時，該環肽在柱中下降的速度較慢，有利于該環肽在樹脂內的擴散，讓樹脂與該環肽得以更加充分的接觸和吸附，上樣流速變快時，上樣液中的環肽成分未能充分的擴散到樹脂內就被沖出柱外，使樹脂對環肽的吸附率降低。對照圖2，1和2 BV/h時均有較大的吸附率，綜合時間考慮，選擇2 BV/h為最佳上樣流速。

圖1 大孔吸附樹脂靜態吸附動力學曲線

圖2 上樣流速對D101大孔樹脂吸附效果的影響

2.3.2 不同上樣質量濃度對大孔樹脂吸附效果的影響

由圖3可知，D101樹脂吸附率隨著上樣液質量濃度增加而降低，1 mg/mL時對應的吸附率最大，這也符合低質量濃度有利于吸附的原則。隨著上樣質量濃度增加，吸附率下降程度逐漸增大，可能是上樣質量濃度大時，環肽對于大孔樹脂的吸附存在競爭，同時上樣質量濃度過大會導致大孔樹脂柱堵塞，影響使用。1和3 mg/mL的吸附率相差不大，綜合時間、效率考慮，選擇3 mg/mL為最佳上樣質量濃度。

圖3 上樣質量濃度對大孔樹脂吸附效果的影響

2.3.3 不同上樣量對大孔樹脂吸附效果的影響

由圖4結果可以看出，隨著上樣量增加，流出液中環肽質量濃度不斷增加，根據泄漏點的定義，上樣量7 BV時，此時的流出液中環肽質量濃度達到上樣液中環肽質量濃度的10%，繼續增加上樣量，會使流出液環肽質量濃度繼續增加。因此，優選最佳上樣量為7 BV。

圖4 上樣量對大孔樹脂吸附效果的影響

2.4 大孔樹脂對該環肽的動態解吸條件優化

2.4.1 不同體積分數乙醇對大孔樹脂解吸條件的影響

由圖5可知，體積分數40%的乙醇進行洗脫時，流出液中檢測不到環肽，說明40%乙醇不能使目標物洗脫，即可以用來除去雜質；乙醇體積分數60%時，環肽開始有少量泄露；隨著乙醇體積分數增大，解吸率也隨之提高，乙醇體積分數100%時，解吸率最高。因此，優選100%乙醇作為洗脫液。

圖5 乙醇體積分數對大孔樹脂解吸條件的影響

2.4.2 洗脫劑量對大孔樹脂解吸條件的影響

由圖6可知，洗脫液中環肽含量隨洗脫液增加而呈現先上升后下降趨勢，洗脫量達到3 BV時，流出液中環肽含量較低，此時環肽基本被洗脫，因此最佳洗脫劑量為3 BV。

2.5 純化工藝驗證

結果見表3，可以得出，縱條紋炭角菌粗提物中Xylastriamide A純度為4.13%，經過大孔樹脂純化后，該環肽含量平均純度為39.63%，純化后該環肽純度有極大提高，說明D101對縱條紋炭角菌中的環肽Xylastriamide A純化效果良好。

圖6 洗脫劑量對大孔樹脂解吸條件的影響

表3 Xylastriamide A在大孔樹脂中純化前后對比

3 結論與討論

通過比較4種大孔吸附樹脂（H101、HP20、D101、AB-8）對縱條紋炭角菌中環肽Xylastriamide A的吸附-解析效果影響，同時對D101大孔樹脂的靜態吸附及靜態動力學進行研究，結果表明，D101大孔樹脂對縱條紋炭角菌中環肽Xylastriamide A具有較好的吸附-解吸作用，且綜合成本考慮，選用D101大孔吸附樹脂來分離純化縱條紋炭角菌中環肽。

D101大孔樹脂對縱條紋炭角菌中環肽動態吸附-解吸的最佳工藝條件為上樣液質量濃度3 mg/mL，上樣流速2 BV/h，上樣量7 BV；解吸時用40%乙醇3 BV洗去雜質，用100%乙醇3 BV解吸，解吸流速2 BV/h。

D101大孔樹脂經過多次的吸附-解吸試驗，其依然具有良好的吸附效果，說明D101大孔樹脂具有較好的重復利用性，且樹脂預處理簡單，成本低廉，安全無害，適合工業生產或者大規模利用。采取該工藝分離縱條紋炭角菌中環肽Xylastriamide A可以減少環肽損失，提高環肽純度，也為用D101樹脂來分離純化其他類型的環肽研究奠定基礎，提供一定參考價值。