超聲波協同纖維素酶法提取生姜中姜酚的工藝條件優化

周泊寧，孫晶*

錦州醫科大學食品科學與工程學院（錦州 121001）

生姜，屬姜科植物。在我國，除東北外大部分地區均有栽培。作蔬菜和調味品供食。《本草綱目》記載：“姜，辛而不葷，去邪辟惡，生啖熟食，醋、醬、糟、鹽、蜜煎調和，無不宜之，可蔬可茹，可果可藥，其利博矣。”為溫肺暖脾養生食品[1]。現代研究表明生姜還具有良好的抗氧化活性以及藥用價值，受到了國內外學者的廣泛關注[2]。生姜中的化學成分極其復雜，主要分為兩個部分，一部分是具有辛辣風味的非揮發性物質，另一部分是具有濃厚香氣的揮發性物質[3]。普遍認為非揮發性提取物為生姜中的主要活性部分，姜酚是生姜中的辣味物質，也是生姜中的有效部分之一。現有研究證實姜酚具有抗潰瘍、抗氧化、可以刺激血液循環以及防衰老抑制腫瘤等多種功效[4]。姜酚的種類有很多，其中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚含量較多[5]。因為姜酚類化合物化學性質不穩定，極易受到酸、堿等因素影響，所以姜酚的提取分離及含量的測定都具有較大難度，對于生姜中姜酚提取工藝的研究具有現實意義[6]。常見的生姜提取物輔助提取技術包括微波法、超聲輔助提取法及生物輔助提取法等[7]。在超聲波輔助法中可運用超聲波作用產生空化效應和強烈的振動加快目標提取物的溶出。纖維素酶作為健康安全的復合酶，在食品加工過程中被廣泛使用[8]。纖維素酶依據植物細胞壁的組成成分，利用酶的高度專一性等特點，在普通溶劑提取的基礎上，加入相應的酶對樣品進行預處理，將生姜細胞壁的組成成分降解或者水解，把細胞壁的結構破壞，增加其通透性，使目標物質暴露出來。膠溶或溶解于溶劑中，達到增強細胞內溶物質溶出的目的，是提取胞內有效成分的一種新型提取方法[9]。對于纖維素酶法協同超聲波提取生姜中活性物質研究較少，試驗通過響應面法對纖維素酶協同超聲波法提取姜酚的工藝進行優化，探討對姜酚提取率的影響，以期獲得高效的姜酚提取方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

萊蕪大姜（錦州市大潤發超市）。

纖維素酶（30 U/mg）、香草醛標準品、沒食子酸標準品（純度99%）（上海惠世生化試劑有限公司）；濃硫酸、無水乙醇、苯酚、碳酸鈉、葡萄糖、福林酚試劑（均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

UV-2550紫外分光光度儀（日本Shimadzu公司）；HH-S2型電熱恒溫水浴鍋（金壇市良友儀器有限公司）；電子分析天平（北京奧多利斯天平有限公司）；GL20M高速冷凍離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；201D型旋轉蒸發儀（鞏義予華儀器有限公司）；真空冷凍干燥機（美國Labconco公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 生姜提取液的制備

精密稱取0.2 g低溫烘干，過孔徑0.150 mm篩的生姜粉末，加入適量纖維素酶溶液溶解于蒸餾水中。酶解后的液體在50 ℃下用無水乙醇進行萃取，將雜質沉淀后對樣品用超聲法處理30 min得到生姜提取液，將提取液以5 000 r/min離心10 min，抽濾，取上清液待用[10]。

1.3.2 香草醛標準曲線的繪制

因為香草醛標準品與姜酚結構相似，所以選用香草醛作為對照標準，繪制標準曲線[11]。配制20 μg/mL香草醛標準溶液，用無水乙醇稀釋定容，得到質量濃度分別為2，4，6，8，10和12 μg/mL的系列標準溶液，用無水乙醇作為空白對照。用比色皿在波長280 nm處測定的吸光度，求得回歸方程為y=0.067 3x-0.004 7，R2=0.999 3。

圖1 香草醛標準曲線

1.3.3 姜酚的測定

用無水乙醇稀釋上清液于10 mL容量瓶中定容，利用紫外分光光度法測定姜酚得率。在波長280 nm處測定吸光度，根據標準曲線得出姜酚質量濃度，按式（1）計算出姜酚得率[12]。

姜酚得率=2.001V0V1C/（V2W×106）×100% （1）式中：2.001為香草醛換算成姜酚的系數；V0為樣品提取液總體積，mL；V1為測定樣液總體積，mL；C為溶液質量濃度，μg/mL；V2為測定時吸取的樣品供試液體積，mL；W為稱取的樣品質量，g。

1.3.4 單因素試驗設計

1.3.4.1 纖維素酶添加量對姜酚得率的影響

準確稱取5份粉碎干燥的生姜粉末，料液比1︰70（g/mL），酶解溫度45 ℃時，分別在纖維素酶添加量為0.40%，0.85%，1.30%，1.75%和2.20%條件下提取60 min，用功率為135 W、溫度60 ℃的超聲波清洗機中提取30 min，考察纖維素酶添加量對姜酚得率的影響。

1.3.4.2 酶解溫度對姜酚得率的影響

準確稱取5份粉碎干燥的生姜粉末，料液比1︰70（g/mL），纖維素酶添加量1.30%時，溫度分別為35，40，45，50和55 ℃酶解60 min，采用功率135 W、溫度60 ℃的超聲波清洗機中提取30 min，考察酶解溫度對姜酚得率的影響。

1.3.4.3 酶解時間對姜酚得率的影響

準確稱取5份粉碎干燥的生姜粉末，料液比1︰70（g/mL），纖維素酶添加量1.30%，酶解溫度45 ℃下分別酶解40，50，60，70和80 min，采用功率135 W、溫度60 ℃的超聲波清洗機中提取30 min，考察酶解時間對姜酚得率的影響。

1.3.4.4 超聲功率對姜酚得率的影響

準確稱取5份粉碎干燥的生姜粉末，料液比1︰70（g/mL），纖維素酶添加量1.30%，溫度45 ℃下酶解60 min，功率分別為105，120，135，150和165 W，在溫度60 ℃的超聲波清洗機中提取30 min，考察超聲功率對姜酚得率的影響。

1.3.5 響應面法試驗因素水平設計

在單因素試驗基礎上，選取纖維素酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）、超聲功率（D）4個因素作為自變量，編碼水平為-1，0和1，以姜酚得率為響應值設計四因素三水平響應面試驗，利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken中心組合試驗設計原理進行響應面試驗[13-15]。結果見表1。

表1 響應面分析的因素水平

1.4 數據處理

所有數據均進行3次測定，p＜0.05被認為具有統計學差異，結果表示為平均值±標準差（X±SD）。數據統計分析采用Design-Expert 8.0.6，差異顯著性（p＜0.05）；趨勢線使用Microsoft Excel軟件計算繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 纖維素酶添加量對姜酚得率的影響

圖2為不同纖維素酶添加量對姜酚得率的影響。隨著加酶量增大，姜酚得率逐漸增大。因為纖維素酶與生姜細胞壁上的纖維素的結合后結構被破壞，更多的纖維素被水解或降解，增大細胞的通透性，提高姜酚得率。加酶量大于1.30%后，由于生姜細胞壁上的結合位點全部被酶分子占據達到飽和狀態，不會再加強酶解效果[16]。故選擇纖維素酶添加量1.30%為宜。

圖2 纖維素酶添加量對姜酚得率的影響

2.1.2 酶解溫度對姜酚得率的影響

圖3為不同酶解溫度對姜酚得率的影響。隨著溫度升高，姜酚得率逐漸增大。這是由于溫度升高，分子運動加快，有利于酚類物質析出；但溫度高于45 ℃時得率增加幅度明顯減小，是因為有乙醇揮發，可能會破壞提取出的姜酚[17]。故選擇酶解溫度45 ℃為宜。

圖3 酶解溫度對姜酚得率的影響

2.1.3 酶解時間對姜酚得率的影響

圖4為不同酶解時間對姜酚得率的影響。隨著酶解時間增加，姜酚得率逐漸增大。是因為酶解時間短，姜酚提取不充分；但酶解時間60 min后，延長酶解時間，可能由于長時間的浸泡分子結構遭到破壞且有其他雜質溶出導致姜酚的得率降低[18]。故選擇酶解時間60 min為宜。

2.1.4 超聲功率對姜酚得率的影響

圖5為不同超聲功率對姜酚得率的影響。隨著超聲功率增加，姜酚得率增大，這是由于適當強度的超聲功率可以加快酶反應。但功率過大時，超聲波的機械作用可使分子的運動速度增加、植物的細胞結構被破壞，會使生姜中其他組分被提取出來或將提取出的姜酚成分破壞，影響提取效果，導致姜酚得率下降[19]，所以超聲功率大于135 W時得率增加幅度明顯減小。故選擇超聲功率135 W為宜。

圖4 酶解時間對姜酚得率的影響

圖5 超聲功率對姜酚得率的影響

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 回歸模型方差分析

在單因素試驗結果基礎上，選擇纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時間、超聲功率4個因素為自變量，姜酚得率為響應值，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行四因素三水平的響應面試驗設計，結果如表2。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行多元擬合回歸分析得到姜酚得率（Y）的回歸方程：Y=1.90+0.076A-0.056B+0.030C-0.015D+0.01AB+0.018AC-0.035AD-0.020BC+2.500E-003BD+7.500E-003CD-0.13A2-0.069B2-0.090C2-0.083D2。

由表3可知，回歸方程的模型p＜0.01，說明該回歸方程極顯著。F值可以直觀地反應各個因素對姜酚得率的影響大小，并且F值越大，則對響應值的影響也越大。由表3得知，4個因素對姜酚得率影響大小的順序為纖維素酶添加量＞酶解溫度＞酶解時間＞超聲功率。從表3還可以看出一次項A、B和二次項A2、B2、C2、D2和一次項C對姜酚得率影響極顯著，交互項AD對姜酚得率影響顯著，其他因素不顯著。

表2 響應曲面試驗結果

表3 二次回歸模型的方差分析

2.2.2 響應面分析及優化

為進一步探討纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時間、超聲功率對響應值的影響，可視化分析各個因素之間的交互作用，回歸方程響應面如圖6～8。隨著纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時間、超聲功率增大，姜酚得率呈現先升高再降低趨勢，與單因素試驗結果一致，響應面圖都較陡峭且有最大值[20-21]。響應面和等高線三維圖可用于解釋自變量之間的交互作用。從響應面的陡峭程度可判斷兩因素對響應值的作用是否顯著，一般響應面越陡峭，說明兩因素交互作用越顯著[22-24]。

圖6 纖維素酶添加量及酶解溫度對姜酚得率交互作用的響應面和等高線圖

圖7 纖維素酶添加量及超聲功率對姜酚得率交互作用的響應面和等高線圖

圖8 酶解時間及酶解溫度對姜酚得率交互作用的響應面和等高線圖

從圖6可知，當纖維素酶添加量一定時，姜酚得率隨著酶解溫度的增加呈現先升高后減降低的趨勢；酶解溫度一定時，姜酚得率隨著纖維素酶添加量的增加呈現先升高后降低的趨勢。等高線接近圓形，表明纖維素酶添加量與酶解溫度的交互作用不顯著，這與回歸方程方差分析的結果相符。

由圖7可知，纖維素酶添加量一定時，姜酚得率隨著超聲功率增加呈現先增大后減小趨勢；超聲功率一定時，姜酚得率隨著纖維素酶添加量增加呈現先增大后減小趨勢。通過對等高線形狀和響應面的陡峭程度分析，等高線密集，且接近橢圓形，響應面坡度較陡峭，可知纖維素酶添加量與超聲功率交互作用對響應值的影響顯著。

由圖8可知，酶解溫度一定時，姜酚得率隨著酶解時間增加呈現先增大后減小趨勢；酶解時間一定時，姜酚得率隨著酶解溫度增加呈現先增大后減小趨勢。響應面坡度較小且等高線接近圓形，說明酶解溫度與酶解時間交互作用不顯著。因素交互的分析結果驗證回歸模型方差分析結果。

2.2.3 驗證試驗

通過軟件Design-Expert 8.0.6分析得到最佳姜酚提取條件為纖維素酶添加量1.44%、酶解溫度42.91 ℃、酶解時間62.38 min、超聲功率132.67 W，在此條件下姜酚得率的理論值可達1.924 6%。出于對試驗條件的可操作性考慮，進一步將提取工藝條件修正為纖維素酶添加量1.30%、酶解溫度45 ℃、酶解時間60 min、超聲功率135 W。經3次驗證性試驗，姜酚得率為1.89%，與理論預測值相近，說明該響應面結果可靠。

3 結論

對超聲波輔助纖維素酶法提取生姜中姜酚的工藝進行優化。通過單因素試驗考察纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時間和超聲功率4個因素對姜酚得率的影響，在單因素試驗結果的基礎上進行Box-Behnken中心組合設計和響應面分析，結果表明纖維素酶添加量和酶解溫度對姜酚得率的影響極顯著，酶解時間影響顯著，而超聲功率不顯著。兩因素間的交互作用對姜酚得率影響較明顯的是纖維素酶添加量和超聲功率。優化后的姜酚得率提取工藝為纖維素酶添加量1.30%、酶解溫度45 ℃、酶解時間60 min、超聲功率135 W。在該條件下實際測得姜酚得率為1.89%，與理論預測值相近，說明試驗所建立的回歸模型較為準確，優化方案合理可行。