熱回流法提取米糠中植物甾醇的工藝優化及分離純化

孫莉莉，王維宇，王振強*，王皓

1. 黃河水利職業技術學院（開封 475004）；2. 天津科技大學食品工程與生物技術學院（天津 300457）

米糠主要是由果皮、種皮、外胚乳、糊粉層和胚加工制成的，是稻谷深加工的主要副產品[1]。我國是世界上最大的稻米生產國，稻谷產量占世界總產量的37%左右[1]，年產稻谷2億 t以上，占全國糧食產量的42%。我國米糠年產量約1 000萬 t[2]，是一種量大而廣的可再生資源。但是一般情況下米糠的利用率只有10%～15%，主要用于生產米糠油、肌醇、植酸和谷維素等。據測定，米糠中含有豐富的植物甾醇，研究顯示，每天攝入1.3 g植物甾醇，搭配合理膳食，可改善血脂異常。植物甾醇是一種活性成分，具有營養價值高、生理活性強等特點[3]，能夠有效維持體內膽固醇平衡的作用，減少心血管病的風險，被科學家們譽為生命的鑰匙，被廣泛應用在食品、醫藥、化妝品等領域[4]。植物甾醇具有良好的抗氧性，可作食品添加劑、動物生長劑原料，促進動物生長，增進動物健康[4]。該研究從米糠中提取植物甾醇具有方法簡單、成本較低、提取效率高等特點，為稻谷深加工的主要副產品——米糠的綜合利用和植物甾醇綜合開發提供理論支撐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠，河南山信糧業集團；植物甾醇標準品，上海甄準生物科技有限公司；乙酸乙酯、甲醇、無水乙醇、磷酸、濃硫酸、氫氧化鈉、丙酮、三氯化鐵、正己烷等試劑，均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UVmini-1240紫外可見分光光度計，日本島津公司；SP-2102UV型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；SHB-III循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；RE-3000A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；BS224s型電子天平，北京市奧多利斯系統有限公司；TDL-5-A臺式離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

準確稱取一定量的米糠，干燥，粉碎，采用不同孔徑的篩網過篩后備用。

1.3.2 植物甾醇標準曲線的繪制

采用硫磷鐵法測吸光度。準確稱取10 g FeCl3·6H2O，充分溶解于磷酸中，定容至100 mL；配制10%的三氯化鐵溶劑，置于棕色瓶中；取1.5 mL 10%的三氯化鐵溶劑置于100 mL棕色定量瓶內，加濃硫酸定容至刻度。準確稱取一定量的植物甾醇標準品，用無水乙醇溶解，混合均勻，配制成質量濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mg/mL的溶液[5]，分別加入3 mL磷酸鐵試劑，振蕩混勻，在波長520 nm處測吸光度。以植物甾醇標準品質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線[6]，如圖1所示。線性方程為y=0.861 6x-0.057 6，R2=0.999 1。

1.3.3 植物甾醇得率計算

采用標準曲線法測定植物甾醇得率，按式（1）計算。

圖1 植物甾醇標準曲線

式中：V為測定液樣品的體積，mL；C為植物甾醇的質量濃度，mg/mL；M為稱取的植物甾醇提取物樣品的質量，g。

1.3.4 植物甾醇提取的單因素試驗

1.3.4.1 提取溶劑的影響

準確稱取5 g米糠，篩網孔徑0.125 mm，料液比1：14（g/mL），分別加入70 mL乙醇、乙酸乙酯、石油醚和正己烷等提取溶劑，溫度80 ℃，時間6 h，進行提取。提取完成后，對提取液進行過濾、旋轉蒸發、烘干，經石油醚溶解，取0.3 mL溶液，加4.7 mL無水乙醇、3 mL磷酸鐵試劑，振蕩混勻，在波長520 nm處測吸光度，分析不同的溶劑對植物甾醇得率的影響。

1.3.4.2 提取溫度的影響

準確稱取5 g米糠，篩網孔徑0.125 mm，料液比1：14（g/mL），加入70 mL乙酸乙酯溶劑，溫度分別為50，60，70，80和90 ℃，時間6 h，進行提取。提取完成后，對提取液進行過濾、旋轉蒸發、烘干，經石油醚溶解，取0.3 mL溶液，加4.7 mL無水乙醇、3 mL磷酸鐵試劑，振蕩混勻，在波長520 nm處測吸光度，分析提取溫度對植物甾醇得率的影響。

1.3.4.3 提取時間的影響

準確稱取5 g米糠，篩網孔徑0.125 mm，料液比1：14（g/mL），加入70 mL乙酸乙酯溶劑，溫度80℃，時間分別為2，4，6，8和10 h，進行提取。提取完成后，對提取液進行過濾、旋轉蒸發、烘干，經石油醚溶解，取0.3 mL溶液，加4.7 mL無水乙醇、3 mL磷酸鐵試劑，振蕩混勻，在波長520 nm處測吸光度，分析提取時間對植物甾醇得率的影響。

1.3.4.4 料液比的影響

準確稱取5 g米糠，篩網孔徑0.125 mm，料液比分別為1：8，1：10，1：12，1：14和1：16（g/mL），加入70 mL乙酸乙酯溶劑，溫度80 ℃，時間6 h，進行提取。提取完成后，對提取液進行過濾、旋轉蒸發、烘干，經石油醚溶解，取0.3 mL溶液，加4.7 mL無水乙醇、3 mL磷酸鐵試劑，振蕩混勻，在波長520 nm處測吸光度，分析料液比對植物甾醇得率的影響。

1.3.4.5 篩網孔徑的影響

分別選用孔徑為0.425，0.250，0.180，0.150和0.125 mm的篩網對米糠過篩，準確稱取5 g，料液比1：14（g/mL），加入70 mL乙酸乙酯溶劑，溫度80℃，時間6 h，進行提取。提取完成后，對提取液進行過濾、旋轉蒸發、烘干，經石油醚溶解，取0.3 mL溶液，加4.7 mL無水乙醇、3 mL磷酸鐵試劑，振蕩混勻，在波長520 nm處測吸光度，分析篩網孔徑對植物甾醇得率的影響。

1.3.5 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，選取提取溫度、提取時間、料液比、篩網孔徑4個因素，以植物甾醇得率為考察指標，按表1進行正交試驗。

表1 正交試驗因數水平

1.3.6 分離純化

1.3.6.1 皂化-萃取提純

將提取液真空干燥后添加乙醇（95%）溶劑，充分溶解后，按料液比1：10（g/mL）加入氫氧化鈉，溫度70 ℃，皂化時間5 h，進行皂化反應，對植物甾醇提取物初步純化。皂化結束后，對皂化液進行離心，取上清液旋轉蒸發，得到植物甾醇粗提物。選擇石油醚為萃取劑，對皂化后的粗提物連續萃取3次，對植物甾醇提取物進一步純化。

1.3.6.2 重結晶提純

利用甲醇作為溶劑，采用升溫溶解、降溫結晶的方式，對皂化-萃取提純后的植物甾醇提取物進行重結晶提純。按表2配制5組甲醇-植物甾醇提取物（液料比）樣品，分別加入一定量的甲醇，升溫溶解，混合均勻后，放入冰箱5 ℃冷藏，放置24 h后，抽濾，用冷甲醇沖洗濾餅及產品，于50 ℃真空干燥，每組樣品重結晶3次，分析甲醇與提取物的液料比對植物甾醇重結晶提純的影響。

表2 甲醇-植物甾醇提取物的液料比

2 結果與分析

2.1 植物甾醇提取的單因素試驗結果

2.1.1 提取溶劑的影響

由圖2可知，采用乙醇、乙酸乙酯、石油醚和正己烷作為提取溶劑，植物甾醇得率的大小順序為乙酸乙酯＞石油醚＞正己烷＞乙醇，乙酸乙酯的提取效果明顯優于其他試劑。綜合分析，選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑對植物甾醇得率的影響

2.1.2 提取溫度的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的增大，植物甾醇得率逐漸提高；當溫度為80 ℃時，植物甾醇得率最大；再增大提取溫度，植物甾醇得率緩慢減小[7]。這是因為增大提取溫度能夠促進植物甾醇的有效溶出；提取溫度過高，可能導致植物甾醇的穩定降低。綜合分析，選擇提取溫度80 ℃比較合適。

圖3 提取溫度對植物甾醇得率的影響

2.1.3 提取時間的影響

由圖4可知，隨著時間的增加，植物甾醇得率逐漸增大[7]。當提取時間為6 h時，植物甾醇得率基本趨于穩定；再延長提取時間，植物甾醇得率增加不明顯。這是因為延長提取時間有利于植物甾醇提取，隨著提取的進行，各物質的濃度逐漸減小，再延長提取時間，提取效果增加不明顯。綜合分析，選擇提取時間6 h比較合適。

2.1.4 料液比的影響

由圖5可知，隨著料液比的增加，植物甾醇得率逐漸提升。當料液比為1：14（g/mL）時，植物甾醇得率比較高；之后再增大溶劑用量，植物甾醇得率增加不明顯。這是因為提取開始階段，增加溶劑用量有利于植物甾醇的有效溶出；當提取進行到一定程度時，各物質的濃度比較小，繼續增加溶劑用量，植物甾醇得率提升不明顯。綜合分析，選擇料液比1：14（g/mL）比較合適[8]。

圖4 提取時間對植物甾醇得率的影響

圖5 料液比對植物甾醇得率的影響

2.1.5 篩網孔徑的影響

由圖6可知，篩網孔徑為0.125 mm時，植物甾醇得率最大，隨著篩網孔徑的增大，植物甾醇得率逐漸減小，當篩網孔徑增大到0.150 mm時，再繼續增大篩網孔徑，植物甾醇得率急劇降低。這是因為，篩網孔徑越大，米糠過篩后顆粒越大，提取時越不利于植物甾醇的有效溶出。綜合分析，篩網孔徑為0.125 mm比較合適。

2.2 正交試驗結果

由表3可知，熱回流法從米糠中提取植物甾醇的最佳工藝條件為A2B2C3D3，即提取溫度70 ℃、提取時間6 h、料液比1：14（g/mL）、篩網孔徑0.125 mm；提取溫度、提取時間、料液比、目數等因素對植物甾醇得率的影響主次順序為B＞D＞A＞C，即提取時間＞篩網孔徑＞提取溫度＞料液比。在此條件下進行驗證試驗，植物甾醇得率為4.43 mg/g。

圖6 篩網孔徑對植物甾醇得率的影響

表3 正交試驗結果

由表4可知，提取時間對結果具有顯著性影響（p＜0.05），提取溫度、料液比和目數對結果無顯著性影響（p＞0.05）[9]。

表4 方差分析結果

2.3 分離純化

2.3.1 皂化-萃取提純

經皂化反應、初步提純，采用石油醚為萃取劑，連續萃取3次，對植物甾醇提取物進一步純化，植物甾醇含量為12.21%。

2.3.2 重結晶提純

利用甲醇作為溶劑，對皂化-萃取提純后的植物甾醇提取物進行重結晶提純，每組試樣重結晶3次，結果見表5。不添加甲醇溶劑時，植物甾醇含量較低，但是植物甾醇收率比較高；添加甲醇溶劑后，隨著甲醇溶劑的增加，植物甾醇含量逐漸提升，但是植物甾醇收率較低。綜合分析，當甲醇-植物甾醇提取物液料比為3：1（mL/g）時，重結晶提純效果最好，植物甾醇含量為67.31%。

表5 重結晶提純結果

3 結論

熱回流法從米糠中提取植物甾醇的最佳工藝條件為A2B2C3D3，即提取溫度70 ℃、提取時間6 h、料液比1：14（g/mL）、篩網孔徑0.125 mm。在此條件下進行驗證試驗，植物甾醇得率為4.43 mg/g；提取溫度、提取時間、料液比、目數對植物甾醇得率的影響主次順序為B＞D＞A＞C，即提取時間＞篩網孔徑＞提取溫度＞料液比；提取時間對結果具有顯著性影響（p＜0.05），提取溫度、料液比和篩網孔徑對結果無顯著性影響（p＞0.05）。經皂化反應、初步提純，采用石油醚為萃取劑，多次萃取，對植物甾醇提取物進一步純化，植物甾醇含量為12.21%；在此基礎上，利用甲醇作為溶劑，進行重結晶提純，當甲醇-植物甾醇提取物的液料比為3：1（mL/g）時，重結晶提純效果最好，植物甾醇含量為67.31%。