沙棘籽粕蛋白控制酶解富含精氨酸肽的工藝優化

歐陽道福，相歡，崔春*

1. 完美（廣東）日用品有限公司（中山 528400）；2. 華南理工大學食品科學與工程學院（廣州 510640）

沙棘（Hippophae rhamnoidesLinn.）為胡頹子科（Elaeagnaceae）沙棘屬（Hippophae），是一種落葉性灌木，為中國西部地區最具代表性的經濟作物之一[1]。沙棘中含有多種生物活性物質，如維生素、黃酮、三萜、蛋白質、脂肪酸類、有機酸和糖等[2]。

沙棘籽粕是提取沙棘籽油后的副產物，脫脂沙棘籽粕是沙棘超臨界二氧化碳提取沙棘油后的副產物，其蛋白質含量豐富，為25%～30%[3]，且氨基酸種類齊全，包含人體全部的必需氨基酸[4]。如果可以將這部分蛋白質充分利用，酶解加工成小分子活性肽，可以提高沙棘蛋白的消化利用率[5]。對于沙棘籽粕及沙棘籽粕蛋白的酶解較多[6]。連偉帥等[7]采用堿性蛋白酶對沙棘籽渣進行酶解，結合超濾膜超濾分別得到分子質量500～2 000 Da的促生長發育多肽以及2 000～

3 500 Da的免疫抗病多肽。王茂廣[8]研究堿性蛋白酶酶解制備沙棘籽粕蛋白抗氧化肽，結果表明沙棘籽粕蛋白酶解物具有較強的還原能力。陳彤[9]采用木瓜蛋白酶水解沙棘蛋白制備醒酒肽。研究表明，沙棘蛋白中精氨酸含量較高，且精氨酸對于糖脂代謝有很大作用[10]。Hu等[11]的研究表明，精氨酸通過調節一氧化氮信號通路從而起到減肥的作用。另外，L-精氨酸是動物體內一種具有特殊營養活性的堿性氨基酸，其代謝產物肌酸、胍丁胺、NO和多胺等在動物機體能量與脂肪代謝、肌肉發育與蛋白合成等動物營養調控方面發揮著非常重要的作用[12]，尤其是NO和多胺途徑對動物的信號轉導及對營養物質代謝的調節具有重要的意義。而富含精氨酸的肽通過消化進入胃腸道可以起到以上作用。但是尚未見到關于沙棘籽粕蛋白控制酶解制備富含精氨酸功能性肽的報道。

因此，以實驗室自提的沙棘籽粕蛋白為原料，以蛋白回收率、水解度和精氨酸含量為指標，篩選酶解效果較好的酶制劑；通過單因素試驗結合響應面模型優化沙棘蛋白酶解的最優工藝，并測定其肽分子質量分布和苦味值，以期為沙棘籽粕蛋白深加工及利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘籽粕蛋白（實驗室從完美康普高原特色植物研究中心提供的沙棘籽粕原料中自行提取獲得[13]）；堿性蛋白酶（Acalase，2 500 U/g）；胰蛋白酶（Trypsin，8 000 U/g）；復合蛋白酶（Protamex，8 500 U/g）；風味蛋白酶（Flavourzyme，5 000 U/g，諾維信中國有限公司）；α-萘酚；次氯酸鈉；氫氧化鈉；無水乙醇（廣州從源儀器有限公司）；精氨酸（純度98%，上海博奧生物科技有限公司）；標準品（Sigma試劑公司）：牛血清蛋白（MW=68 000），細胞色素C（MW=12 500），抑酞酶（MW=6 500），桿菌肽（MW=1 450），Gly-Gly-Tyr-Arg（MW=451），Gly-Gly（MW=123.5）。

色譜柱TSKgel G2000SWXL（Tosoh Bioscience LLC，德國）；紫外-可見光分光光度計（UV765，上海佑科儀器有限公司）；氨基酸分析儀（日立L8900，廈門慶期壹貿易有限公司）；高速冷凍離心機（GL21M，長沙湘智離心機有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 指標測定

1.2.1.1 蛋白質回收率與水解度的測定

蛋白質含量測定采用凱氏定氮法[14-15]，蛋白質轉換系數為6.25。氨氮含量測定采用甲醛滴定法[16]。蛋白質回收率按式（1）計算，水解度按式（2）計算。

1.2.1.2 精氨酸含量測定

采用坂口反應[17]測定精氨酸含量。精氨酸標準曲線的制作：分別配制10，20，40，60，80和100 μg/mL的精氨酸溶液。分別加入5 mL精氨酸溶液（1 mg/mL）、0.2%的α-萘酚（500 μL）、10%氫氧化鈉（500 μL）、500 μL有效氯為1%的次氯酸鈉和500 μL 40%的尿素，加入后反應80 s，全波長掃描之后其最大吸收波長為501 nm。精氨酸的標準曲線方程為Y=0.006 1X+0.006 8，其中X表示精氨酸濃度（μg/mL），Y表示吸光度，R2=0.997 6。精氨酸含量按式（3）計算。

1.2.2 沙棘蛋白酶解工藝中酶的篩選

稱取4 g沙棘蛋白，加入100 g超純水，調節pH 8.0，分別加入堿性蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶、復合蛋白酶（0.2%，以蛋白含量計），于55 ℃反應不同時間（10，30，60，120，180，240和300min），取樣測定蛋白質回收率和精氨酸含量。

1.2.3 單因素試驗

以蛋白質回收率和精氨酸含量為指標，以pH、酶解溫度、酶添加量為變量進行單因素試驗。具體步驟：（1）配制4%蛋白溶液，調節pH 7，8，9，10，11和12，堿性蛋白酶和胰蛋白酶添加量0.25%，于55 ℃反應3 h；（2）配制4%蛋白溶液，調節至pH 11，酶添加量0.25%，于45，50，55和60 ℃反應3 h；（3）配制4%蛋白溶液，調節至pH 11，添加不同濃度的酶（0.05%，0.10%，0.20%和0.30%），于50 ℃反應3 h。

1.2.4 響應面試驗設計

通過單因素試驗測定的水平范圍，應用Design-Expert 8.0軟件，以蛋白質回收率和精氨酸含量為響應面指標，設計三因素三水平的響應面試驗，利用響應面試驗結果，確定沙棘籽粕蛋白最佳酶解工藝。響應面試驗因素水平見表1。

表1 響應面因素水平

1.2.5 氨基酸組成分析

氨基酸測定參考Su等[18]的方法。采用日立L-8900型全自動氨基酸分析儀測定樣品中氨基酸的含量。樣品預處理：準確稱取100 mg樣品，小心加入專用水解管中，加入5 mL 1︰1的分析純鹽酸（約6 mol/L）。酒精噴燈封管后置烘箱中于110 ℃水解22～24 h；樣品過濾和定容。水解后的樣品取出冷卻至室溫，開管后用小漏斗和濾紙過濾到25或50 mL容量瓶中，水解管用去離子水洗滌3次，洗滌液過濾到容量瓶中，用去離子水洗滌濾紙，洗滌液也收集到小容量瓶中。定容至刻度線；吸取1～2 mL定容后的樣品，置烘箱中脫酸。溫度60 ℃，脫至干燥，底部留有少許固體或痕漬為止；脫酸后的樣品，加入1～3 mL樣品緩沖液，置震蕩混合器上混合均勻，針管吸取少量，經0.22～0.45 μm過濾器過濾后裝入試劑瓶中上機分析。

1.2.6 肽相對分子質量分布測定

參考Zheng等[19]的方法，稍作修改。測定沙棘籽粕蛋白及其酶解產物的肽相對分子質量分布。流動相（V（乙腈）︰V（水）=20︰80，0.1%三氟乙酸），流速0.5 mL/min。相對分子質量校正曲線：分別用流動相配制成質量分數0.1%的不同相對分子質量標準品溶液（牛血清蛋白、細胞色素C、抑酞酶、桿菌肽、Gly-Gly-Tyr-Arg，Gly-Gly），經0.45 μm濾膜過濾，分別進樣（進樣量20 μL），得到系列標準品的色譜圖。以相對分子質量的對數（lgMW）對保留時間作圖，得到分子校正曲線及其方程。

1.2.7 酶解產物的苦味鑒定

苦味評定參照文獻[20-21]的方法，稍作修改。分別由8名（男女各4名）受過專業訓練的感官評定員對酶解液的苦味進行品評，將苦味分為強（4～6分）、中（1～3分）、弱（0～1分）3個等級，以去離子水作為參照（分值為0分），對試驗樣品的苦味打分，酶解液苦味的最終得分為8位感官評定員打分的平均值。

1.3 數據處理

所有試驗均重復3遍，數據均為3次測定的平均值，響應面采用Design-Expert 8.0軟件分析處理，顯著性分析采用Minitab 17.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白酶對沙棘蛋白酶解效果的影響

分別采用堿性蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶和胰蛋白酶對沙棘蛋白進行酶解，蛋白質回收率及水解度的結果如圖1（A）所示。結果表明，隨著反應時間延長，蛋白質回收率和水解度均呈現增長的趨勢。蛋白質回收率的大小為堿性蛋白酶＞胰蛋白酶＞復合蛋白酶＞風味蛋白酶。堿性蛋白酶和胰蛋白酶酶解產物的蛋白回收率明顯高于其他2種酶。反應時間超過3 h后，蛋白回收率沒有顯著性增長。

如圖1（B）所示，對4種酶而言，精氨酸含量大小為復合蛋白酶＞堿性蛋白酶＞胰蛋白酶＞風味蛋白酶。隨著酶解時間延長，除風味蛋白酶酶解產物外，其余3種酶解產物的精氨酸含量呈現下降的趨勢，這可能是因為隨著時間延長，上清液中蛋白質含量不斷增加，而精氨酸部分可能會出現在沉淀中，從而導致精氨酸含量整體下降。結合蛋白質回收率和精氨酸含量，選擇堿性蛋白酶和胰蛋白酶進行單因素試驗。

圖1 不同蛋白酶對沙棘籽粕蛋白的酶解效果

2.2 不同pH對沙棘蛋白酶解效果的影響

如圖2所示，隨著pH增加，蛋白質回收率呈現增加趨勢，并且胰蛋白酶整體高于堿性蛋白酶，且pH 11時蛋白質回收率最大，繼續增加pH對蛋白回收率沒有顯著性提高。同時精氨酸含量隨著pH增加呈現波動，但整體并未呈現大幅下降，因此，結合蛋白質回收率，選擇pH 11作為后續試驗的最佳pH。

2.3 酶解溫度對沙棘蛋白酶解效果的影響

如圖3所示，隨著酶解溫度增加，蛋白質回收率呈現先增長后下降趨勢，且在50 ℃時出現較大值，胰蛋白酶酶解的蛋白質回收率整體大于堿性蛋白酶，同時精氨酸含量隨著溫度的增加呈現先增長后下降趨勢，因此，結合蛋白質回收率，選擇50 ℃作為后續試驗的最佳反應溫度。

圖2 不同pH對沙棘籽粕蛋白酶解的影響

圖3 不同酶解溫度對沙棘蛋白酶解的影響

2.4 酶添加量對沙棘蛋白酶解效果的影響

如圖4所示，隨著酶添加量增加，蛋白質回收率和精氨酸含量均呈現增長趨勢，且加酶量高于0.2%時，蛋白質回收率和精氨酸含量未呈現顯著性增長。胰蛋白酶酶解效果整體優于堿性蛋白酶，選擇酶添加量0.2%作為后續試驗的最佳酶添加量。根據單因素試驗結果，選擇胰蛋白酶進行響應面模型驗證。

圖4 不同加酶量對沙棘籽粕蛋白酶解的影響

2.5 胰蛋白酶酶解工藝響應面優化試驗

2.5.1 響應面回歸模型的建立與分析

通過響應面法，對初始pH、溫度、加酶量3個單因素進行分析，得到試驗方案及結果，見表2。應用Design-Expert 8.0軟件進行多元回歸擬合分析，得到分析結果，如表3所示。

表2 響應面試驗設計及結果

酶解條件與沙棘籽粕蛋白回收率之間的二次多項模型為

蛋白質回收率=88.36-8.60A+0.66B+2.38C-5.35AB-0.10AC+1.89BC-54.92A2-9.29B2-9.89C2

酶解條件與精氨酸含量之間的二次多項模型為

精氨酸含量=0.16+(2.276E-003)A+(3.072E-003)B+(1.828E-003)C-(2.428E-003)AB+(2.229E-003)AC-0.012BC-(9.405E-003)A2-0.024B2-0.016C2

由表3可以得出，蛋白質回收率的回歸模型具有高度顯著性（p＜0.000 1），而失擬項（p=0.203＞0.05）不顯著。A、C達到顯著水平，表明試驗模擬擬合度較好。AB，A2，B2，C2對沙棘籽粕蛋白回收率有顯著影響（p＜0.05），而其他因素影響不顯著。由方差分析F值可知，各因素對沙棘籽粕蛋白酶解蛋白回收率的影響依次為pH＞酶添加量＞溫度。

另外，精氨酸含量的回歸模型也具有高度顯著性（p＜0.01），失擬項（p=0.127＞0.05）不顯著。A、C達到顯著水平，表明試驗模擬擬合度較好。AC，A2，B2，C2對沙棘籽粕蛋白回收率有顯著影響（p＜0.05），而其他因素影響不顯著。由方差分析F值可知，各因素對沙棘籽粕蛋白酶解蛋白回收率的影響依次為溫度＞pH＞酶添加量。

表3 方差分析

2.5.2 最佳工藝的預測和驗證

通過二次多項回歸分析預測，采用響應面回歸模型確定沙棘籽籽粕蛋白酶解的最佳工藝：pH 11.16，溫度50.26 ℃，酶添加量0.18%。在此條件下，蛋白質回收率為88.75%，精氨酸含量為0.155 g/g。結合生產實際，工藝參數修正為pH 11，溫度50 ℃，酶添加量0.18%。在此條件下，測得蛋白質回收率為88.01%，精氨酸含量為0.158 g/g，與模型預測值無顯著性差異。因此，所得最佳工藝合理可靠。

2.6 沙棘蛋白酶解產物氨基酸含量測定

由表4可知，酶解前和酶解后的氨基酸種類相同，均被檢測出17種氨基酸；酶解之后的水解氨基酸總量降低，這可能是因為酶解過程中，部分肽段因相互作用而聚集形成沉淀。酶解前與酶解后的氨基酸的百分比差異較小。沙棘蛋白中含量較高的氨基酸分別是谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸，分別占總量的23.72%，16.16%和11.48%，酶解產物中這3種氨基酸的比例分別為23.5%，16.5%和11.85%。

表4 沙棘籽粕蛋白及酶解產物氨基酸含量

2.7 肽分子質量分布以及苦味評價

分子質量校正曲線為Y=-3.193 8X+26.724，其中X表示分子質量的對數值，Y表示出峰時間。樣品經過液相處理之后，根據分子質量校正曲線計算相應的分子質量，并得出相應的峰面積，得到樣品的肽分子質量分布。如表3所示，沙棘蛋白原料的分子質量較大，而經過酶解之后，分子質量明顯降低。堿性蛋白酶酶解之后的肽分子質量中小于1 kDa的部分占到49%，多屬于小分子肽；而胰蛋白酶酶解之后的肽分子質量5～10 kDa居多，且具有較多的大分子質量的肽段，所以胰蛋白酶酶解之后的樣品的味道較好。

表5 沙棘籽粕蛋白及酶解液的肽分子質量分布單位：%

3 結論

試驗以沙棘籽粕蛋白為原料，利用響應面法優化酶法水解工藝，為其高值化利用提供理論指導。不同蛋白酶對沙棘蛋白的酶解效率不同，其中胰蛋白酶和堿性蛋白酶酶解效果較好，且胰蛋白酶酶解產物可以有效降低苦味，減少后期工藝生產中的脫苦環節。結合單因素試驗和響應面模型驗證，確定胰蛋白酶酶解沙棘蛋白的最優工藝：pH 11，溫度50 ℃，酶添加量0.18%。在此條件下，最大蛋白質回收率為88.75%，精氨酸含量為0.155 g/g。實際測得蛋白質回收率為88.01%，精氨酸含量為15.8%，與模型預測值無顯著性差異。氨基酸測定結果表明，沙棘蛋白中含量較高的氨基酸分別是谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸，分別占總量的23.72%，16.16%和11.48%。胰蛋白酶控制酶解對于精氨酸的含量起到富集作用。分子質量分布表明，經過酶解之后，大相對分子質量蛋白轉化為可溶性的小分子肽，且富含精氨酸，為后期開發富含精氨酸肽的產品提供工藝基礎。