響應面法優化小米黃色素提取工藝

米智，劉荔貞*，武曉紅

1. 山西大同大學生命科學學院（大同 037009）；2. 山西大同大學化學與環境工程學院（大同 037009）

谷子（Setaria italicL.），亦稱粱、稷、粟，在植物學上屬禾本科狗尾草屬。它起源于中國，距今約有一萬多年的栽培歷史[1-2]，是世界上最為古老的雜糧農產品之一。谷子脫殼后稱小米（foxtail millet），是一種藥食兩用的優質雜糧。小米含豐富的蛋白、脂肪、膳食纖維、多種維生素及硒、鐵等多種人體所必需的礦物質[3]；含有豐富的賴氨酸，可用作大多數谷物的補充蛋白質來源[4]，含有淀粉酶抑制劑、芥子油苷、多酚和單寧等化合物[5]。現代醫學表明，小米中多酚類物質具有較好的抗氧化活性[6]，具有降血糖、降膽固醇及預防潰瘍等生理功效[7-8]。小米蛋白水解產物還可以緩解高血壓和相關心血管疾病[9]。小米中多酚對金黃色葡萄球菌、腸膜明串珠菌、蠟狀芽孢桿菌和糞腸球菌的生長均有一定的抑制作用[10]。谷糠中的過氧化物酶（FMBP）蛋白質，發現其具有抗結腸癌的作用[11]。

小米顏色常見的有黃色、白色、青灰色、黃綠色等，其中90%以上谷子品種的小米是黃色，黃色的主要來源為黃色素。米色是衡量小米品質的重要指標，小米米色越黃，即黃色素含量越高，米飯的口感越好[12]。谷子籽粒的黃色素主要在胚乳中積累，谷糠和谷殼中很少，成熟期籽粒中黃色素水平逐漸升高，過度成熟后迅速下降[13]。噴施外源硒能顯著提高谷子的黃色素含量[14]。小米黃色素主要成分為天然類胡蘿卜素，主要含有葉黃素（3, 3’-二羥基-α-胡蘿卜素）、玉米黃質（素）（3, 3’-二羥基-β-胡蘿卜素）以及少量的隱黃質（素）（3-羥基-β-胡蘿卜素）、β-胡蘿卜素等[15-16]。小米黃色素具有一定的耐熱性、耐還原性和耐氧化性，對光和酸性條件穩定性較差，不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑，其乙醇提取物最大吸收波長為445～446 nm[17-18]。這些類胡蘿卜素為天然的抗氧化物質，具有重要的醫療保健價值[19]。不僅具有保護視覺與上皮細胞的作用，而且可以提高人體免疫力，淬滅體內過多自由基，預防多種癌癥，同時對口腔潰瘍、皮膚病等都有很好的療效[20]。小米黃色素可用作多種食品、飲料及糖果等的著色劑，具有顏色鮮明、色澤圓潤自然同時兼具營養保健的作用[18,21]。從生物體中提取的天然色素，相比于合成色素，具有更高的安全性及保健功效，且著色色調更接近天然物質顏色[22-23]。

對于測定和提取小米黃色素的報道很多，而用索氏提取法測定小米黃色素鮮見報道。該方法具有選擇性好、能耗低、設備、操作簡便等優點，適于實驗室應用[24]；小米黃色素易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑，而且經常用于食品工業中，因此在考慮溶劑的提取率的同時還需考慮其安全環保性。乙醇毒性低且沸點低，適于索氏提取法進行小米黃色素的提取，且使用乙醇為提取劑時回收利用方便。試驗以小米為研究對象，利用響應面試驗探究索氏提取法提取小米黃色素的最佳工藝條件，為小米黃色素的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米（東方亮，產自山西廣靈）；β-胡蘿卜素標準品（美國ChromaDex公司）；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司），精密電子天平（上海精密儀器儀表有限公司），數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司），紫外/可見分光光度計（上海元析儀器有限公司），高速中藥粉碎機（上海比朗儀器制造有限公司），索氏提取器（鄭州利康儀器設備有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1β-胡蘿卜素標準曲線的建立

參照王海棠等[17]的方法，并做修改。準確稱取10mgβ-胡蘿卜素標準品，加95%乙醇，在超聲波輔助下，搖勻使之充分溶解并定容至50 mL，得0.2 mg/mLβ-胡蘿卜素標準液。用95%乙醇配制不同質量濃度梯度的β-胡蘿卜素溶液，以95%乙醇為空白對照，在445 nm處用紫外/可見分光光度計測定吸光度，測3次求平均值，做回歸處理。

1.3.2 小米處理及小米黃色素提取工藝流程

選擇無發霉、無機械傷、無病蟲害、顆粒飽滿的當年收獲的新谷子，放入電熱恒溫鼓風干燥箱中，在45～50 ℃下干燥2 h后，碾制成小米，用萬能粉碎機粉碎成小米粉末，并使小米粉通過孔徑0.200 mm篩，收集小米粉末于干燥、避光的容器中保存待用。

小米黃色素提取工藝流程：小米→粉碎→過篩→稱重→分裝→乙醇浸提→提取液定容→離心取上清→測定吸光度→計算提取量。

1.3.3 小米黃色素含量的測定方法

精確量取1 mL提取液作為待測液，方法同1.3.1，在445 nm處測吸光度，做3組平行試驗求平均值，代入線性回歸方程，得到小米黃色素的含量。

式中：C為小米黃色素質量濃度，mg/mL；N為稀釋的倍數；V為提取液總體積，mL；W為試驗樣品的質量，g。

1.3.4 小米黃色素提取工藝的單因素試驗

1.3.4.1 乙醇體積分數

準確稱取2 g小米粉末，在料液比為1：4（g/mL）、提取時間3.0 h、回流次數3次的前提下，設置乙醇體積分數80%，85%，90%，95%和100%提取小米黃色素，在445 nm處測定提取液的吸光度，并計算小米黃色素的提取量。

1.3.4.2 料液比

準確稱取2 g小米粉末，在乙醇體積分數95%、提取時間3.0 h、回流次數3次的前提下，設置料液比1：3，1：4，1：5，1：6和1：7（g/mL）提取小米黃色素，在445 nm處測定提取液的吸光度，并計算小米黃色素的提取量。

1.3.4.3 提取時間

準確稱取2 g小米粉末，在乙醇體積分數95%、料液比1：4（g/mL）、回流次數3次的前提下，設置提取時間1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 h提取小米黃色素，在445 nm處測定提取液的吸光度，并計算小米黃色素的提取量。

1.3.5 響應面試驗設計及統計學處理方法

根據小米黃色素提取工藝的單因素試驗結果，從乙醇體積分數、料液比和提取時間3個因素中，分別選取3個對小米黃色素提取量影響最大的水平，以小米黃色素提取量為考察目標，運用Design-Expert V 8.0.6.1軟件進行響應面試驗設計，根據Box-Behnken中心組合設計原理，確定相應面試驗方案，并建立回歸方程預測模型確定最佳提取工藝參數。

1.3.6 小米黃色素提取工藝的驗證性試驗和樣品加標回收率計算

為了更好地證實索氏提取法提取小米黃色素的可靠性和合理性，每個單因素試驗結果樣品多取3份，添加β-胡蘿卜素標準品溶液，計算樣品加標回收率。在響應面試驗結果的基礎上，進行3次平行驗證性試驗，并計算相對標準偏差（σRSD）。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以β-胡蘿卜素濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線，得出線性回歸方程y=0.197x+0.112，R2=0.991。

2.2 小米黃色素提取工藝的單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對小米黃色素提取量的影響

由圖1可知，當乙醇體積分數低于95%時，小米黃色素提取量隨乙醇體積分數增大而提高；當乙醇體積分數為95%時，小米黃色素提取量達到最大，約為8.23 mg/kg；當乙醇體積分數超過95%后，隨著乙醇體積分數的提高，小米黃色素提取量反而略有降低。因此，在做響應面試驗時，選取乙醇體積分數90%，95%和100%作為三水平。

圖1 乙醇體積分數對小米黃酮提取量的影響

2.2.2 料液比對小米黃色素提取量的影響

由圖2可知，小米黃色素提取量隨著料液比的增大而提高，當料液比為1：4（g/mL）時，小米黃酮提取量達到最大值，約為8.34 mg/kg；當料液比繼續增大時，小米黃色素提取量反而降低。因此，在做響應面試驗時，選取料液比1：3，1：4和1：5（g/mL）作為三水平。

圖2 料液比對小米黃酮提取量的影響

2.2.3 提取時間對小米黃色素提取量的影響

由圖3可知，當提取時間為1.5～3.5 h時，小米黃色素提取量隨提取時間延長而提高，且提取3.5 h時小米黃色素提取量達到最大值，約為8.09 mg/kg，但提取3.0 h時的小米黃色素提取量約為8.07 mg/kg，幾乎與3.5 h時小米黃色素提取量相當。因此，在做響應面試驗時，選取提取時間2.5，3.0和3.5 h作為三水平。

2.3 回歸模型的建立及其分析

響應面分析因素與水平見表1。響應面試驗方案與結果見表2。

圖3 提取時間對小米黃酮提取量的影響

表1 響應面分析因素與水平

表2 響應面試驗方案與結果

建立小米黃色素提取工藝參數的回歸模型，獲得試驗評價指標（小米黃色素提取量）的響應值對自變量A（乙醇體積分數）、B（料液比）和C（提取時間）的二次多項式回歸方程：小米黃色素提取量（Y）=-202.951+3.347 35×A+9.285 5×B+20.666 5×C+9.0×10-3×AB+9.0×10-3×AC-0.33×BC-0.017 79×A2-1.177 25×B2-3.179×C2。

以小米黃色素提取量為評價指標對該模型進行方差分析及模型系數進行顯著性檢驗（表3）。回歸模型在統計學上呈極顯著（p=0.000 5＜0.01），說明試驗模型有統計學意義；且通過p值可知模型中變量C、B2和C2對提取量影響極顯著，B和A2對提取量影響顯著，說明試驗因素與響應值不是簡單的線性關系，二次項對相應值也有很大的關系，三因素的交互作用影響相對較小；失擬項p=0.170 8＞0.05，不顯著，說明試驗模型擬合度較好，選擇是正確的，模型的殘差可能來源于試驗過程的隨機誤差。模型的校正決定系數R2Adj=0.903，說明小米黃色素提取量試驗中90.3%的變異分布在方程的9個因子中，其總變異僅有9.7%不能由該模型來解釋，R2=0.957 6，說明提取量的實測值與預測值之間具有較好的擬合度，該模型可用于預測小米黃色素提取量的實際情況。噪音信號比的比率為11.699（＞4），說明模型能真實地反映試驗結果；試驗的精確度為4.16%，說明試驗操作可靠。在所選取的各因素水平范圍內，影響響應值的順序為提取時間（C）＞料液比（B）＞乙醇體積分數（A），其中提取時間對小米黃色素提取量影響極顯著（p=0.001＜0.01），料液比對提取量影響顯著（p=0.036 8＜0.05）。

表3 回歸模型方差分析

通過三維響應面圖和二維等高線圖分析顯示，隨著乙醇體積分數、料液比和提取時間的增大或延長，小米黃色素提取量也隨之增大，但當乙醇體積分數、料液比和提取時間增大或延長到一定程度后，小米黃色素提取量有下降的趨勢（圖4～圖6），三因素之間的交互作用相當，而且從等高線圖中可得，橢圓程度和疏密程度也相當，與模型回歸中的方差分析一致。

圖4 乙醇體積分數和料液比對小米黃色素提取量的響應面圖（A）和等高線圖（B）

圖5 乙醇體積分數和提取時間對小米黃色素提取量的響應面圖（A）和等高線圖（B）

圖6 料液比和提取時間對小米黃色素提取量的響應面圖（A）和等高線圖（B）

2.4 最佳提取條件的確定

由響應面法試驗分析數據可得出小米黃色素最佳提取取工藝：乙醇體積分數95.86%、料液比1：3.86（g/mL）、提取時間3.19 h。此時提取量為8.35 mg/kg。考慮實驗室操作的可行性，修正提取工藝條件：乙醇體積分數95%、料液比1：4（g/mL）、提取時間3.0 h。

2.5 樣品加標回收率和優化條件的驗證性試驗

通過3組樣品加標回收試驗結果計算得到回收率在93.78%～103.33%之間，說明索氏提取法提取小米黃色素準確、可靠。根據響應面試驗篩選出小米黃色素提取的最佳工藝，進行3組平行試驗，驗證響應面試驗結果的可靠性和準確性。由驗證性試驗測定可知，小米黃色素提取量分別為8.24，8.01和7.77 mg/kg。3組平行樣數據相對標準偏差（σRSD）為2.94%，精密度和重復性均能滿足要求，表明該提取工藝小米黃酮提取量較為穩定。

3 結論

由響應面試驗結果及方差分析可知，索氏提取法提取小米黃色素的最佳工藝為乙醇體積分數95%、料液比1：4（g/mL）和提取時間3.0 h。影響程度為提取時間＞料液比＞乙醇體積分數，提取時間對小米黃色素提取量影響極顯著，料液比對提取量影響顯著。樣品加標回收率為93.78%～103.33%，σRSD較小（2.94%），說明索氏提取法提取小米黃色素工藝精確、可靠。響應面試驗能對各個因素及各因素之間的交互分析得更全面、更細致，能較為準確地分析出因素間最佳組合，試驗穩定可靠，可為今后研究小米黃色素等成分的提取提供試驗依據。