水解度對牡蠣酶解產物功能特性和抗氧化活性的影響

楊昭，黃佳佳，姚玉靜*，曾琳琦，凌葉婷

廣東食品藥品職業學院食品學院（廣州 510520）

牡蠣（oyster）是一種低脂肪高蛋白的水產品，含有豐富的蛋白質（45%～57%）、牛磺酸（50.6 mg/g）、總糖（18%～39%）和微量元素（硒、鋅）等，擁有極高的營養價值和保健價值[1]。近十年來，我國牡蠣養殖產量逐年增加，年產量超過400萬 t[2]。鑒于牡蠣具有較高的營養價值和較大的產量，蛋白質酶解技術已被廣泛應用于牡蠣的水解，以獲得具有良好感官品質、功能特性、生理活性和營養價值的酶解產物[3]。但獲得合適酶解產物受到多種因素的影響，包括酶種類、底物和水解條件（如酶的濃度、溫度、pH和時間）[4]。通過控制水解條件可以提高酶解產物的品質和功能特性，如乳化性和起泡性[5]。適度酶解可以強化酶解產物的功能特性，但酶解過度會造成一些功能特性喪失[6]。因此，控制蛋白質的水解程度對于獲得具有較佳功能特性的酶解產物至關重要。

水解度是表征蛋白質水解程度的重要指標。近年來，越來越多研究者關注水解度對水產品酶解產物功能特性和抗氧化活性的影響。袁曉晴等[6]制備水解度為DH 4.5%，9.0%和13.5%鳙魚肉酶解產物，發現DH 4.5%酶解產物乳化性和起泡性最高，而過度水解后，DH 9.0%和13.5%酶解產物乳化性和起泡性下降。馬艷芳等[7]發現螺旋藻肽的起泡性、DPPH清除率和還原力，隨著水解度增加呈現先增大后減小趨勢，而泡沫穩定性、乳化性和乳化穩定性則隨著水解度增大而逐漸減小。周航等[8]制備水解度分別為7.5%，9.4%，10.3%，11.6%和14.6%的鰱魚肉酶解產物，發現脂質過氧化抑制率、ABTS+·清除率和還原力均隨水解度增大而升高。盧彬等[9]制備水解度分別為10.8%，14.9%，19.0%和21.7%鲹魚肉酶解產物，發現隨著水解度增大，酶解產物乳化性、乳化穩定性、起泡性和泡沫穩定性逐漸降低。研究表明，水解度對酶解產物的功能特性和抗氧化活性有重要影響，且不同原料呈現不同規律。前期研究發現，水解度對牡蠣酶解液的感官評分、肽分子量分布和游離氨基酸組成有較大影響[10]。酶解產物組成的差異會引起其功能特性和生理活性變化。現鮮有水解度對牡蠣酶解產物功能特性和抗氧化活性影響的報道。

因此，試驗以牡蠣肉為原料，采用胰蛋白酶和風味蛋白酶組成復合酶對其進行限制性水解，獲得不同水解度的酶解產物，考察水解度對牡蠣酶解產物功能特性（乳化性、起泡性和泡沫穩定性）和抗氧化活性（DPPH清除率和總還原力）的影響，旨在為牡蠣酶解產物的工業化應用提供研究基礎和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

近江牡蠣肉（購自廣州龍洞農貿市場，現場去殼取肉后，冰鮮保存，立即運回實驗室-18 ℃凍藏）；風味蛋白酶（酶活500 LAPU/g，諾維信中國公司）；胰蛋白酶（酶活4 000 U/g，重慶市全新祥盛生物制藥有限公司）；2, 2-二苯基-1-苦味基肼（DPPH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；濃硫酸、氫氧化鈉、鹽酸等（均為分析純）。

DKZ-3B電熱恒溫振蕩水槽（上海一恒科學儀器有限公司）；3K15臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；K9840凱氏定氮儀（濟南海能儀器股份有限公司）；TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；T25高壓均質機（艾卡（廣州）儀器設備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶解產物制備

稱取等重量解凍的牡蠣肉和蒸餾水，混合后迅速打漿，調整漿液pH 7.0，加入牡蠣肉總重量0.6%復合蛋白酶（胰蛋白酶與風味蛋白酶的質量比2︰1），攪拌均勻后在55 ℃水浴搖床中分別酶解不同時間。酶解結束后，煮沸滅酶20 min。室溫冷卻后在4 ℃條件下以8 000 r/min離心20 min，取上清液-18 ℃凍存備用[1]。酶解時間分別為0，30，60，240和480 min的酶解產物，分別標記為OH0、OH1、OH2、OH3和OH4。

1.2.2 水解度測定

總氮含量測定采用凱氏定氮法。氨基酸態氮含量測定采用甲醛滴定法[11]。水解度（DH）按照式（1）計算。

1.2.3 乳化性能

酶解產物用蒸餾水稀釋3倍后，取30 mL稀釋后的酶解產物至燒杯中，分別調節pH 4，6，8和10，加入30 mL大豆油，以10 000 r/min均質2 min，迅速將乳化液倒入100 mL離心管中，以3 000 r/min離心5 min，離心后測量乳化層體積[2-3]。

1.2.4 起泡性和泡沫穩定性

酶解產物用蒸餾水稀釋3倍后，取30 mL稀釋后的酶解產物至燒杯中，分別調節pH 4，6，8和10，以10 000 r/min高速均質2 min后迅速轉移至量筒中，量取起始泡沫體積，記錄之后5，10，20，30和60 min時的泡沫體積[8]。起泡性及泡沫穩定性按照式（3）和（4）計算。

1.2.5 DPPH的測定

酶解產物用蒸餾水稀釋4倍后，取2 mL稀釋后的酶解產物于10 mL離心管中，加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，混勻，室溫避光放置30 min。以無水乙醇調零，于517 nm波長處測定吸光度[4]。計算如式（5）。

式中：A0為2.0 mL樣品溶液+2.0 mL無水乙醇的吸光度；A1為2.0 mL DPPH溶液+2.0 mL無水乙醇的吸光度；A2為2.0 mL樣品溶液+2.0 mL DPPH溶液的吸光度。

1.2.6 總還原力的測定

酶解產物用蒸餾水稀釋1倍后，取1 mL稀釋后的酶解產物于10 mL離心管中，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.6）和2.5 mL 1%鐵氰化鉀，混勻，50 ℃水浴20 min，冷卻至室溫，加2.5 mL 10%三氯乙酸，混勻。取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵，混勻。以蒸餾水調零，于700 nm波長處測定吸光度[5]。

1.3 數據處理

所有測定均進行3次重復試驗，取平均值。

2 結果與分析

2.1 牡蠣酶解產物的水解度

蛋白質水解后成為多肽和游離氨基酸，多肽是酶解產物功能特性和抗氧化活性的主要貢獻者。不同水解度的酶解產物中多肽分子量分布范圍和含量不同。通常水解度越高，多肽分子量分布范圍越小，小分子肽含量越高，但呈現較強功能特性和抗氧化活性的多肽分子量具體是多少，未有一個明確的參考依據。因此，探究水解度對酶解產物功能特性和抗氧化活性的影響，是酶解產物中功能性肽和抗氧化肽分離和鑒定的基礎，也是酶解產物應用的基礎。如圖1所示，采用胰蛋白酶和風味蛋白酶組成復合酶對牡蠣進行限制性水解，酶解時間分別為0，30，60，240和480 min時，獲得OH0、OH1、OH2、OH3和OH4這5種酶解產物，水解度分別為8.02%，24.75%，28.04%，36.98%和41.20%。牡蠣在貯藏和預處理過程中，其中的內源蛋白酶也會對蛋白質進行酶解，發生蛋白質自溶的過程[6]。因此，酶解時間0 min的牡蠣酶解產物，其水解度也需要被測定和考察。

圖1 牡蠣酶解產物的水解度

2.2 乳化性

乳化性是指能將油水結合在一起形成乳狀液的能力，是食品加工中重要的性質和質量控制指標。如圖2所示，在pH 4環境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4乳化性分別為44.46%，42.29%，44.61%，42.81%和43.76%。在pH 6環境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4乳化性分別為44.44%，45.13%，45.81%，43.75%和43.03%。在pH 8環境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4乳化性分別為45.82%，44.56%，43.08%，43.44%和44.27%。在pH 10環境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4乳化性分別為41.98%，41.82%，39.97%，39.81%和40.38%。數據分析表明，不同水解度牡蠣酶解產物在不同pH環境中的乳化性差別較小，表明水解度對牡蠣酶解產物乳化性的影響較小。

圖2 不同水解度牡蠣酶解產物的乳化性

2.3 起泡性和泡沫穩定性

起泡性是蛋白質應用于食品加工的一項重要功能性質。如圖3所示，在pH 4環境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4起泡性分別為53.84%，56.39%，26.92%，21.40%和16.53%。在pH 6環境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4起泡性分別為68.15%，70.07%，58.55%，40.99%和29.59%。在pH 8環境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4起泡性分別為52.57%，51.82%，37.56%，24.96%和13.79%。在pH 10環境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4起泡性分別為46.13%，55.41%，31.53%，36.11%和18.69%。數據分析表明，OH1在4種pH環境中均有較強的起泡性，在pH 6環境中起泡性最大為70.07%。在pH 4和6環境中，牡蠣酶解產物的起泡性隨著水解度的增加呈現先升高后降低的趨勢。在pH 8環境中，牡蠣酶解產物的起泡性隨著水解度的增加呈現逐漸降低的趨勢。在pH 10環境中，牡蠣酶解產物的起泡性則無明顯規律。表明水解度對牡蠣酶解產物起泡性的影響較大。

由圖4可知，在pH 4環境中，OH3和OH4的泡沫穩定性較強，泡沫穩定性5 min時分別為93.27%和92.06%。OH1在5，10，20，30和60 min時的泡沫穩定性分別為76.74%，75.58%，70.93%，62.79%和23.26%，表明OH1在pH 4環境中，30 min內具有超過50%的泡沫穩定性。由圖5可知，在pH 6環境中，OH4的泡沫穩定性較強，泡沫穩定性在5 min時為96.67%。OH1在5，10，20，30和60 min時的泡沫穩定性分別為68.08%，64.32%，58.69%，56.34%和28.17%。表明OH1在pH 6環境中，30 min內仍具有超過50%的泡沫穩定性。由圖6可知，在pH 8環境中，OH3和OH4的泡沫穩定性較強，泡沫穩定性在5 min時為分別為91.60%和95.34%。OH1在5，10，20，30和60 min時的泡沫穩定性分別為77.07%，73.89%，68.79%，64.33%和50.89%。表明OH1在pH 8環境中，60 min內具有超過50%的泡沫穩定性。由圖7可知，在pH 10環境中，OH1、OH2、OH3和OH4均具有較強的泡沫穩定性，泡沫穩定性在5 min時為分別為85.63%，85.36%，84.30%和84.30%。OH1在5，10，20，30和60 min時的泡沫穩定性分別為77.07%，73.89%，68.79%，64.33%和50.89%。表明OH1在pH 10環境中，60 min內仍具有超過50%的泡沫穩定性。

圖3 不同水解度牡蠣酶解產物的起泡性

圖4 pH 4時不同水解度牡蠣酶解產物的泡沫穩定性

圖5 pH 6時不同水解度牡蠣酶解產物的泡沫穩定性

圖6 pH 8時不同水解度牡蠣酶解產物的泡沫穩定性

圖7 pH 10時不同水解度牡蠣酶解產物的泡沫穩定性

數據分析表明，OH4在4種pH環境中均有較強的泡沫穩定性。OH1在pH 4和6環境中，30 min內仍具有超過50%的泡沫穩定性。在pH 8和10環境中，60 min內仍具有超過50%的泡沫穩定性。表明水解度對牡蠣酶解產物泡沫穩定性的影響也較大。

2.4 DPPH清除率

DPPH清除率是表征抗氧化劑體外抗氧化活性的重要指標。DPPH是一種穩定的有機自由基，溶于乙醇時溶液呈深紫色，有自由基清除劑存在時，可與其單電子配對使其溶液褪色，吸光度下降，其褪色程度與自由基清除能力呈正相關。如圖8所示，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4的DPPH清除率分別為35.33%，67.00%，66.00%，76.00%和72.67%。牡蠣酶解產物的DPPH清除率，隨著水解度增加，呈現先升高后降低趨勢。牡蠣經酶解后，其DPPH清除率提高將近1倍，原因可能是酶的作用使原本隱藏在牡蠣蛋白質內部并且能夠增強肽抗氧能力的氨基酸殘基暴露出來，生成單電子配對能力強的產物，易于與DPPH結合。OH3的DPPH清除率最高為76.00%。隨著水解度增加，OH4的DPPH清除率有所下降，可能因為抗氧化活性肽過度水解，單電子配對能力強的產物生成量下降，從而導致DPPH清除率降低。這與馬艷芳等[7]報道螺旋藻肽的DPPH清除率規律一致，隨著水解度增加，螺旋藻肽的DPPH清除率呈現先升高后降低趨勢。

2.5 總還原力

在總還原力測定中，700 nm處的吸光度與樣品的還原能力成正比。吸光度越大，樣品的還原能力越強。如圖9所示，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4的總還原力分別為0.296，0.304，0.318，0.367和0.395。牡蠣酶解產物的總還原力，隨著水解度增加呈現逐漸升高趨勢。這與周航等[8]報道鰱魚酶解產物總還原力的規律一致，鰱魚酶解產物總還原力隨水解度增加，吸光度逐漸增大，總還原力逐漸增強。

圖8 不同水解度牡蠣酶解產物的DPPH清除率

圖9 不同水解度牡蠣酶解產物的總還原力

3 結論

試驗采用胰蛋白酶和風味蛋白酶組成復合酶對牡蠣進行限制性水解，獲得OH0、OH1、OH2、OH3和OH4這5種酶解產物，水解度分別為8.02%，24.75%，28.04%，36.98%和41.20%，考察水解度對牡蠣酶解產物功能特性（乳化性、起泡性和泡沫穩定性）和抗氧化活性（DPPH清除率和總還原力）的影響。結果表明，水解度對牡蠣酶解產物乳化性影響較小，對起泡性、泡沫穩定性、DPPH清除率和總還原力影響較大。OH1在pH 4，6，8和10環境中均有較強的起泡性，在pH 6環境中起泡性最大為70.07%。在pH 4和6環境中，隨著水解度增加，牡蠣酶解產物起泡性呈現先升高后降低趨勢。在pH 8環境中，牡蠣酶解產物的起泡性隨著水解度的增加呈現逐漸降低趨勢。OH4在pH 4，6，8和10環境中均有較強的泡沫穩定性。牡蠣酶解產物的DPPH清除率，隨著水解度增加，呈現先升高后降低趨勢。OH3的DPPH清除率最高為76.00%。牡蠣酶解產物的總還原力，隨著水解度增加呈現逐漸升高趨勢。OH4的總還原力最高，為0.395。