酶解豆清液制備抗氧化肽

尹樂斌 *，劉丹，廖聰，楊愛蓮，何平

1. 邵陽學院食品與化學工程學院（邵陽 422000）；2. 邵陽學院豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室（邵陽 422000）

豆清液是豆制品生產過程中的副產物，每加工處理1 t大豆將產生2～5 t豆清液，且豆清液富含氨基酸、異黃酮以及低聚糖等營養成分。大豆多肽是大豆蛋白的水解產物，具有降血壓、抗氧化、抗疲勞等[1-4]優點，在食品、醫藥等行業具有良好的發展前景[5]，且與大豆蛋白相比，大豆多肽的相對分子量較小，更容易被吸收利用。利用豆清液作為多肽產品的原材料可以減少豆清液的浪費，同時也能為企業增添經濟效益。

抗氧化肽是指具有抗氧化活性的肽類物質，在維持機體自由基平衡，提高機體抗衰老能力與抵抗疾病等方面具有重要的作用[6]，利用酶水解蛋白質可獲得具有良好抗氧化活性的多肽，是當前研究熱點之一[7-9]。胃蛋白酶是專一性較強的蛋白酶，具有一定的氨基酸序列選擇特異性，優先斷裂由芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）或亮氨酸形成的肽鍵[10]。有研究表明胃蛋白酶水解蛋白（如米糠蛋白、苦蕎球蛋白、芝麻蛋白等）可獲得具有抗氧化性的水解物[11-14]；Zhang等[15-16]利用堿性蛋白酶酶解得到大豆水解液對DPPH自由基具有較高的清除率，利用所得抗氧化肽評估合成肽對氧化的細胞保護作用人腸道Caco-2細胞的應激反應。但胃蛋白酶水解豆清液制備豆清多肽及其對抗氧化活性研究仍鮮見報道。通過對胃蛋白酶水解豆清液生產多肽的探索研究，旨在為豆清液的再利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

722型可見分光光度計（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；VELOCITY 14R臺式冷凍離心機（Dynamica Scientific Ltd.）；SCIENTZ-18N冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

豆清液（學校果蔬清潔加工實驗室提供）；胃蛋白酶（河北格貝達生物科技有限公司）；2, 2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，上海如吉生物科技發展公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（Shanghai Chemical Industy Park）。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶解液的制備

稱取一定量的豆清液，調節pH，加入胃蛋白酶酶解數小時。酶解結束后取出，于沸水中滅酶10 min，室溫冷卻，在4 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液進行測定。此上清液即為多肽上清液。

1.2.2 多肽質量濃度的測定

多肽質量濃度的測定參照文獻[17]并稍作改動。將豆清液和豆清原液與10%三氯乙酸（TCA）溶液以體積比1︰1加入至2 mL離心管中，靜置10 min，在7 000 r/min下離心15 min。取1 mL上清液加水稀釋至6 mL，加入4 mL雙縮脲溶液，搖勻，靜置30 min后，在540 nm處測定吸光度，用牛血清標準蛋白標準曲線算出多肽質量濃度。按式（1）計算多肽產率。

式中：D為多肽產率，%；h1為酶解后多肽質量濃度，mg/mL；h2為酶解前多肽質量濃度，mg/mL。

1.2.3 抗氧化活性測定

將在最佳工藝條件酶解過的豆清液用真空冷凍干燥機干燥24 h至固體狀的豆清多肽樣品和VC稀釋成不同濃度待測液。ABTS自由基清除率測定參考文獻[18]的方法；DPPH自由基清除率測定參考文獻[19]的方法。

1.2.4 單因素試驗

測定胃蛋白酶在不同條件下，即酶解時間（4，5，6，7和8 h）、酶與底物濃度比（0.5，0.6，0.7，0.8和0.9 g/mL）、初始pH（4.5，4.0，3.5，3.0，2.5和2.0）和酶解溫度（27，32，37，42，47和52 ℃）對水解豆清液的影響。

1.2.5 響應面試驗

在單因素基礎上，以多肽產率為指標應用響應面分析法中Box-Behnken的試驗設計原理優化出最佳工藝參數。

表1 胃蛋白酶酶解產豆清多肽的響應面試驗

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解時間對胃蛋白酶酶解產豆清多肽產率的影響隨著時間延長，多肽產率先逐漸加大到達峰值再逐漸減小，曲線整體呈現開口向下拋物線趨勢。出現這種趨勢可能是因為隨著水解的進行，底物濃度下降，多肽質量濃度增加，多肽與蛋白質出現競爭性抑制作用。而酶活力可能隨著溫度或體系pH改變而降低，出現水解剩余底物能力減弱，或者不具有水解能力[20]。在整個時間段內，多肽產率最大為64.85%，出現在第6小時和第7小時；最小多肽產率為50.63%，出現在第8小時（見圖1）。選用胃蛋白酶水解豆清液的時間為5，6和7 h進行響應面優化。

圖1 酶解時間對胃蛋白酶酶解產豆清多肽產率的影響

2.1.2 酶與底物濃度比對胃蛋白酶酶解產豆清多肽產率的影響

酶與底物濃度比對多肽產率的影響如圖2所示。隨著濃度比增長，多肽產率先逐漸加大到達峰值再逐漸減小，曲線整體呈現開口向下拋物線趨勢。曲線預期趨勢是先上升后趨于平緩，呈現拋物線的原因可能是隨著酶與底物濃度比增多，酶之間出現競爭性抑制或酶自身相互水解，導致酶活力降低。在5個濃度梯度中，多肽產率最大為32.14%，出現在0.7 g/mL；最小多肽產率為25.2%，出現在0.9 g/mL。選用胃蛋白酶水解豆清液的酶與底物濃度比0.6，0.7和0.8 g/mL進行響應面優化。

圖2 酶與底物濃度比對胃蛋白酶酶解產豆清多肽產率的影響

2.1.3 pH對胃蛋白酶酶解產豆清多肽產率的影響

隨著pH增長，多肽產率先逐漸加大到達峰值再逐漸減小，曲線整體呈現開口向下拋物線趨勢，這是因為胃蛋白酶是一種酸性酶且有最適pH，在酸性條件下有較高活性并在最佳酸性條件下活性最高（見圖3）。酶解底物的帶電狀態會因pH變化而改變。底物是蛋白質、肽或氨基酸等兩性電解質時，隨著pH改變底物呈現不同解離狀態，酶的活力部位往往只能作用于底物的一種解離狀態，且酶分子的帶電狀態也會隨著pH發生變化[20]。6個pH梯度中，多肽產率最大為14.54%，出現在pH 4.00；最小多肽產率為8.39%，出現在pH 2.0。選用初始pH 3.5，4.0和4.5進行響應面優化。

2.1.4 溫度對胃蛋白酶酶解產豆清多肽產率的影響

隨著溫度的增長，多肽產率先逐漸加大到達峰值再逐漸減小，曲線整體呈現開口向下拋物線趨勢，蛋白酶作為一種蛋白質類生物催化劑，受溫度影響較大，在一定溫度范圍內，催化反應的速率隨著溫度上升而上升，但是超過一定溫度催化活性反而降低。6個溫度梯度中，多肽產率最大為79.44%，出現在溫度32 ℃；最小多肽產率為62.47%，出現在52 ℃（見圖4）。選用酶解溫度27，32和37 ℃進行響應面優化。

圖3 pH對胃蛋白酶酶解產豆清多肽產率的影響

圖4 溫度對胃蛋白酶酶解產豆清多肽產率的影響

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面結果（表2）

2.2.2 模型建立及顯著性分析

利用軟件Design-Expert Version 8.0.6.1可以得到回歸方程和方差分析表格，見表3。

從表3看到，該多肽產率模型（模型項F值有0.38%的可能是由于干擾）回歸高度顯著（0.000 1≤p＜0.01），失擬項F值（有21.90%的可能性是由于干擾）為2.30意味著相對于純誤差而言，失擬項并不顯著，且R2=0.819 8，R2adj=0.639 6，因此可以用來預測胃蛋白酶水解豆清液生產大豆多肽的工藝。各個因素影響的大小順序為酶解溫度＞酶解pH＞酶與底物濃度比＞酶解時間。D2項p＜0.000 1說明D2項偏回歸系數差異極顯著。

表2 胃蛋白酶酶解產豆清多肽的響應面試驗結果

表3 胃蛋白酶酶解產豆清多肽產率方差分析

2.2.3 最佳工藝條件的確定

使用Design-Expert Version 8.0.6.1軟件，得出胃蛋白酶水解豆清液生產大豆多肽的最佳工藝條件為酶解時間7 h、酶與底物濃度比0.8 g/mL、初始pH 3.5、酶解溫度31.33 ℃。使用該工藝條件，預期大豆多肽產率為39.13%。考慮實際操作，選擇酶解時間7 h、酶與底物濃度比0.8 g/mL、初始pH 3.5、酶解溫度31℃。經驗證試驗得大豆多肽產率為40.08%，與預測值相比無顯著差異，說明通過Design-Expert Version 8.0.6.1軟件分析得到的最佳工藝條件可行。

2.3 抗氧化活性研究試驗

2.3.1 ABTS自由基清除率測定

豆清液酶解物對ABTS自由基均有較強的清除能力，但豆清液酶解物清除能力要弱于VC。在抗氧化試驗所測定范圍內，豆清液酶解物和VC對ABTS自由基清除率均隨自身濃度增大而增強，且VC溶液在0.016 mg/mL時對ABTS自由基清除率達到最大100%，豆清液酶解物在0～0.05 g/mL的濃度范圍內，對ABTS自由基清除率最大達到100%（見圖5）。

圖5 VC和豆清酶解物對ABTS自由基清除率的影響

2.3.2 DPPH自由基清除率測定

豆清酶解物對DPPH自由基清除能力較強，但豆清液酶解物清除能力要弱于VC。在抗氧化試驗所測定范圍內，豆清酶解物和VC對DPPH自由基清除率均隨自身濃度增大而增強，且VC 0.032 mg/mL時對DPPH自由基清除率達到最大95.6%，豆清酶解物0.05 g/mL時對DPPH自由基清除率達到最大98.8%（見圖6）。在試驗測定的范圍外，即VC質量濃度大于0.032 mg/mL和豆清酶解物濃度大于0.05 g/mL，2種樣品對DPPH自由基清除率會繼續增大并最終達到100%。

圖6 VC和豆清酶解物對DPPH自由基清除率的影響

3 結論

在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken原理，利用Design-Export Version 8.0.6.1軟件建立以豆清多肽產率為指標的二次多項式回歸模型，用響應面法優化胃蛋白酶酶解制備豆清多肽的工藝。結果表明，最優工藝條件為酶解最優條件為時間7 h，酶與豆清液濃度比0.8 g/mL、初始pH 3.5、酶解溫度31 ℃，在此條件下多肽產率為40.08%；抗氧化試驗中，豆清多肽對ABTS自由基的清除率最大可達100%，對DPPH自由基的清除率最大可達98.8%。結果表明胃蛋白酶酶解豆清液制備的豆清多肽具有較好的抗氧化性，可作為優質抗氧化肽的良好來源，還需深入探究豆清多肽的結構和性質。胃蛋白酶酶解可有效提高豆清多肽產率，可為豆清多肽的制備和推廣應用提供理論依據，有利于豆清液的再利用。