α-淀粉酶和糖化酶協同酶解葛根淀粉的工藝

陳曉鏑，廖明晰，彭凌*

西南科技大學生命科學與工程學院（綿陽 621010）

葛根又叫葛藤、甘葛、雞齊根等，屬豆科植物。其味甘，性凉，是中國藥食兩用的植物[1]。新鮮葛根含淀粉20%以上、蛋白質2.1%、異黃酮類物質2%，以葛根素為主[2]；還有一些人體必需氨基酸和微量元素等。葛根中的葛根素對高血糖、高血壓、高血脂及心腦血管疾病有一定療效，另外還有防治骨質疏松、抗氧化、抑制病原菌繁殖、保護心肌、保護神經細胞、預防更年期綜合征等功效[3]。試驗對庫存葛根淀粉綜合應用，以單因素與正交因素為基礎，探討其酶解工藝對其影響，為實際生產提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

葛根淀粉（綿陽市山葛農業科技有限公司）；液化酶（即α-淀粉酶，酶活力20 000 U/g，浙江一諾生物科技有限公司）；糖化酶（即β-淀粉酶，酶活力50 000 U/g，南京納滿生物科技有限公司）。

1.2 試驗試劑

碳酸氫鈉、鹽酸、碘化鉀、無水硫酸銅、次甲基藍、酒石酸鉀鈉（四水）、氫氧化鈉、乙酸鋅、冰乙酸、亞鐵氰化鉀、碘（粒狀）、碘化鉀、葡萄糖（均為分析純）；檸檬酸（一水）、異抗壞血酸（均為食品級）。

1.3 儀器與設備

HH-8數顯恒溫水浴鍋（常州市金壇華特實驗儀器有限公司）；PHS-3C酸度計（成都世紀方舟科技有限公司）；UV752紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；BSA223S電子天平（0.001 g，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；LDZ5-2低速自動平衡離心機（北京醫用離心機廠）；DHG-9145A電熱恒溫干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）；DL-1電子萬用爐（北京市永光明醫療儀器廠）；C21-FK2101多功能電磁爐（廣東美的生活電器制造有限公司）。

1.4 分析方法

1.4.1 糊化度的測定方法

采用碘呈色分析法快速測定糊化度。取出糊化液后立即于離心機中以5 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL于50 mL容量瓶中，加去離子水20 mL，加入0.05 mol/L的碘-碘化鉀溶液1 mL，加水定容至50 mL，以碘-碘化鉀溶液為空白，用分光光度計在575 nm波長下測定吸光度，即為其碘呈色度，用碘呈色度即可快速反映糊化度[4]。試驗重復1次，作為重復組。

1.4.2 還原糖的測定方法[5]

采用GB 5009.7—2016的直接滴定法測定還原糖。重復試驗3次。

1.4.2.1 標定堿性酒石酸銅溶液

分別吸取甲液與乙液5.0 mL于錐形瓶，加水10 mL，并加入幾顆玻璃珠，加熱至沸，以葡萄糖標準液趁熱迅速滴定，直至藍色剛好消失為滴定終點，平均3次取平均消耗的葡萄糖量，記為m，即每10 mL堿性酒石酸銅溶液相當于葡萄糖質量（mg）。

1.4.2.2 測定還原糖

吸取淀粉液化液上清液V1mL于250 mL容量瓶，緩慢加入乙酸鋅溶液與亞鐵氰化鉀溶液各5 mL，加水定容并混勻，靜置30 min后過濾，為待測樣液。以錐形瓶為反應容器，吸取酒石酸銅甲液與乙液各5.0mL，水10 mL，加入玻璃珠，加熱至沸，以待測樣液趁熱迅速滴定直到藍色剛好消失，重復3次后記錄平均消耗量V（mL）。

1.4.2.3 計算公式

測得的還原糖質量濃度按式（1）計算。

式中：X為液化液中還原糖質量濃度，g/L或mg/mL；m為堿性酒石酸銅溶液相當于葡萄糖質量，mg；V1為吸取稀釋的液化液體積，mL；F為系數，試驗取0.8；V為測定時平均消耗的待測液體積，mL；250為定容體積，mL；1 000為換算系數。

1.5 試驗設計

1.5.1 糊化試驗

葛根淀粉糊化時，在固液比1：8，1：12，1：16，1：20，1：24和1：28 g/mL，溫度65，70，75，80，85和90 ℃，時間0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0，pH 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0和8.5下水浴加熱。

1.5.2 液化試驗

在α-淀粉酶用量0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%和0.30%，pH 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5和8.0，時間0.25，0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 h，溫度50，55，60，65，70和75 ℃下水浴加熱。

1.5.3 糖化試驗

在β-淀粉酶用量0.1%，0.3%，0.5%，0.8%，1.0%，1.2%和1.5%，pH 3.5，4.0，4.5，5.0，5.5和6.0，時間0.25，0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 h，溫度45，50，55，60，65和70 ℃下水浴加熱。

1.6 工藝優化試驗

在單因素試驗基礎上，篩選出最佳水平進行正交試驗，得出優化工藝條件。

1.6.1 糊化工藝優化

1.6.1.1 固液比

基于70 ℃、pH 8.0下水浴加熱1.5 h，通過設置固液比1：8，1：12，1：16，1：20，1：24和1：28 g/mL[6]，測定糊化度及觀察組織狀態，從而選取最佳3個水平。

1.6.1.2 pH

基于固液比1：16 g/mL、70 ℃下水浴加熱1.5 h，通過設置pH 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0和8.5，測定相應糊化度并觀察組織狀態，從而比較選取最佳3個水平。

1.6.1.3 加熱時間

基于固液比1：16 g/mL、70 ℃、pH 8.0下水浴加熱，通過設置水浴加熱時間0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h，測定相應糊化度并觀察其組織狀態，比較并選取其中最優3個水平。

1.6.1.4 加熱溫度

基于固液比1：16 g/mL、pH 8.0下水浴加熱1.5 h，通過設置水浴加熱溫度65，70，75，80，85和90℃，測定相應糊化度并觀察其組織狀態，比較并選取其中最佳3個水平。

1.6.1.5 正交試驗

以上述4個單因素試驗得出其3個最優水平，通過L9(34)試驗設計，以糊化度及組織狀態為指標，確定最佳糊化條件。4個因素分別為溫度（A）、固液比（B）、pH（C）、時間（D）。

表1 葛根淀粉糊化L9(34)正交試驗因素水平表

1.6.2 液化工藝優化

經預糊化后，通過測定不同淀粉酶用量、酶解溫度、酶解時間、pH下的還原糖質量濃度，優選3個最佳水平，進行正交試驗得出最佳液化工藝條件。

1.6.2.1α-淀粉酶用量

基于pH 7.5、60 ℃下水浴加熱1 h，設置酶用量梯度0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%和0.30%[8]，通過測定還原糖質量濃度選取最佳3個水平。

1.6.2.2 pH

基于酶用量0.15%、60 ℃下水浴加熱1 h，設置pH 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5和8.0[9]，通過測定還原糖質量濃度選取最佳3個水平。

1.6.2.3 酶解時間

基于酶用量0.15%、pH 7.5、60 ℃下水浴加熱，設置加熱時間0.25，0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 h[10]，以還原糖質量濃度為指標，測定并選取最佳3個水平。

1.6.2.4 酶解溫度

基于酶用量0.15%、pH 7.5下水浴加熱1 h，設置溫度50，55，60，65，70和75 ℃，以還原糖質量濃度為指標，測定并選取最佳3個水平。

1.6.2.5 正交試驗

通過L9(34)試驗設計，以還原糖質量濃度為指標，確定其最佳液化條件。選取4個因素分別是酶用量（A）、pH（B）、酶解時間（C）、酶解溫度（D），結合最佳液化的3個水平，制定得其四因素三水平表，如表2所示。

表2 葛根淀粉液化L9(34)正交試驗因素水平表

1.6.3 糖化工藝優化葛根淀粉經糊化、液化之后，通過分析在不同糖化酶用量、酶解溫度、酶解時間、pH下的還原糖質量濃度，確定正交優化試驗，得出最佳糖化工藝條件。

1.6.3.1β-淀粉酶用量

基于pH 5.0、55 ℃下水浴加熱1 h，設置酶用量0.1%，0.3%，0.5%，0.8%，1.0%，1.2%和1.5%[12]，通過測定還原糖質量濃度選取最佳3個水平。

1.6.3.2 pH

基于酶用量1.2%、55 ℃下水浴加熱1 h，設置pH3.5，4.0，4.5，5.0，5.5和6.0[13]，通過測定還原糖質量濃度選取最佳3個水平。

1.6.3.3 酶解時間

基于酶用量1.2%、pH 5.0、55 ℃下水浴加熱，設置加熱時間梯度為0.25，0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 h[14]，以還原糖質量濃度為指標，測定并選取最佳3個水平。

1.6.3.4 酶解溫度

基于酶用量1.2%、pH 5.0下水浴加熱1 h，設置溫度梯度為45，50，55，60，65和70 ℃，以還原糖質量濃度為指標，測定并選取最佳3個水平。

1.6.3.5 正交試驗

通過L9(34)試驗設計，以還原糖質量濃度為指標，確定其最佳糖化條件。選取4個因素分別是酶解溫度（A）、糖化酶用量（B）、pH（C）、酶解時間（D），制得四因素三水平表如表3所示。

表3 葛根淀粉糖化L9(34)正交試驗因素水平表

1.7 試驗數據處理

通過軟件Origin 7.5處理單因素試驗數據，并作曲線圖；通過軟件SPSS 17.0進行正交試驗數據分析。

2 結果與分析

2.1 葛根淀粉糊化工藝優化結果

2.1.1 糊化工藝優化條件分析

從圖1a可見，隨著pH上升，糊化度逐漸升高，在pH 7.0左右變化較為平緩，pH 8.0以后逐漸穩定。所以選取最佳的3個水平為pH 7.5，8.0和8.5。

從圖1b可見，溫度對糊化的影響很大。70 ℃開始，糊化度迅速升高，85 ℃后逐漸平緩，所以選取最佳的3個水平為80，85和90 ℃。

從圖1c可見，糊化時間越長，糊化度越高，糊化時間2.5 h后趨于極限。所以選取最佳的3個水平為2.0，2.5和3.0 h。

從圖1d可見，固液比1：20 g/mL時最高。固液比1：8到1：20 g/mL之間時，加水越多糊化度越高；固液比超過1：20 g/mL后，糊化度較緩慢地降低。所以選取最佳的3個水平為1：16，1：20和1：24 g/mL。

圖1 糊化工藝優化單因素試驗結果

2.1.2 糊化工藝優化正交試驗結果

基于4個單因素試驗選出較優的3個水平做出的正交優化試驗結果如表4所示。

比較表4中各因素所對應的極值可知，影響葛根淀粉糊化度的主次順序為溫度（A）＞時間（D）＞固液比（B）＞pH（C）。正交試驗優選的最優組合為A3B2C1D3，即在90 ℃，固液比1：20 g/mL，pH 7.5下水浴加熱3 h，可得最高糊化度，按最優條件糊化后2次測定其糊化度為27.56%和27.98%。

表4 糊化工藝優化正交試驗設計及結果

2.2 葛根淀粉液化工藝優化結果

2.2.1 液化工藝優化條件分析

由圖2a可知，酶用量越多還原糖質量濃度越高，到0.25%趨于極限。故可以確定最佳3個水平為0.20%，0.25%和0.30%。

由圖2b可知，pH＜7.0時還原糖質量濃度隨pH升高而升高，pH＞7.0時，隨pH升高而有所降低。在酸性環境下的液化效果不好，在pH 7左右比較合適。故選擇3個水平為6.5，7.0和7.5。

由圖2c可知，酶解1 h以內，酶解時間越長，還原糖質量濃度越高。酶解1 h后還原糖質量濃度基本趨平，故可以確定較優3個水平為1.0，1.5和2.0 h。

由圖2d得出，溫度小于60 ℃時，隨著溫度升高，還原糖質量濃度升高；溫度超過60 ℃后，還原糖質量濃度趨于平緩。故可確定較優3個水平為55，60和65 ℃。

圖2 液化工藝優化單因素試驗結果

2.2.2 液化工藝優化正交試驗結果

基于4個單因素試驗所選出較優的3個水平做出的正交優化試驗結果如表5所示。

表5 液化工藝優化正交試驗設計及結果

由表5所示的各因素所對應的極值可以看出，主次因素依次為時間（C）＞酶用量（A）＞溫度（D）＞pH（B），液化工藝最佳因素水平為A3B1C3D3，即在α-淀粉酶用量0.30%，pH 6.5，65 ℃下水浴加熱酶解2 h，其還原糖質量濃度最高，按最優條件液化后2次測定其還原糖質量濃度為18.81和18.25 g/L。

2.3 葛根淀粉糖化工藝優化結果

2.3.1 糖化工藝優化條件分析

由圖3a可以看出，還原糖質量濃度與酶用量成正比，且影響很大。酶用量1.0%之后逐漸趨平，故可以確定3個較優水平為1.0%，1.2%和1.5%。

由圖3b看出，pH 5.0時還原糖質量濃度達到最高，往兩側逐漸減小。故可以選擇出其最優3個水平的pH為4.5，5.0和5.5。

從圖3c可以看出，酶解時間越長，還原糖質量濃度越高，酶解時間1.5 h后逐漸趨于平緩。故可以篩選出較優3個水平為1.0，1.5和2.0 h。

由圖3d可以看出，酶解溫度越高，還原糖質量濃度越高，溫度超過60 ℃之后逐漸趨于平穩。所以可以選出較優3個水平為60，65和70 ℃。

圖3 糖化工藝優化單因素試驗結果

2.3.2 糖化工藝優化正交試驗結果

基于4個單因素試驗所選出較優的3個水平，做出正交優化試驗結果表6所示。

表6 糖化工藝優化正交試驗設計及結果

由表6所示的極差分析可以看出，主次因素依次為pH（C）＞時間（D）＞酶用量（B）＞溫度（A）。糖化工藝最佳因素水平為A2B2C1D2，即在65℃，β-淀粉酶用量1.20%，pH 4.5下水浴加熱酶解1.5 h，其還原糖質量濃度最高，按最優條件糖化后2次測定其還原糖質量濃度為68.94和69.78 g/L。

3 結論

1) 最佳糊化工藝條件為固液比1：20 g/mL，pH 7.5，水浴加熱糊化溫度90 ℃，糊化時間3 h，可得到最佳葛根淀粉糊化液。

2) 最佳液化工藝條件為α-淀粉酶添加0.30%（以淀粉干基計），pH 6.5，水浴加熱酶解溫度65 ℃，酶解時間2 h，可得到最佳淀粉液化液。

3) 最佳糖化工藝條件為β-淀粉酶添加1.2%（以淀粉干基計），pH 4.5，水浴加熱酶解溫度65 ℃，酶解時間1.5 h，可得到最佳淀粉糖化液。