羅漢果花綠原酸的提取和對(duì)DPPH·清除效果

汪洪濤

江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康學(xué)院；江蘇省食品安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心（南京 211168）

羅漢果為葫蘆科屬多年生藤本植物，雌雄異株，原產(chǎn)于廣西、海南等亞熱帶地區(qū)，是我國(guó)特有的藥食兩用植物[1]。羅漢果花取自羅漢果的雄花，味甘、性凉，其中含有豐富的生物活性物質(zhì)，如黃酮類、皂苷、綠原酸、槲皮素等，常以花茶的形式加入茶葉中飲用[2]。羅漢果花具有潤(rùn)肺清熱、通腸利便、增強(qiáng)免疫力的功效，常用于消除咽炎、口腔炎、便秘、口臭等癥狀[3]。目前對(duì)羅漢果的研究較多而對(duì)羅漢果花的研究較少，主要集中在精油、皂苷、黃酮類化合物提取及生理功能的研究[4-6]，醇提物的抗氧化降糖研究[7]和提取液對(duì)果蔬保鮮的研究[8]。

綠原酸即5-咖啡酰奎寧酸，又名咖啡鞣酸，是多酚類化合物，廣泛存在于植物尤其是蕨類植物和雙子葉植物中。研究表明綠原酸具有降血壓、降血脂、清除自由基、對(duì)某些腫瘤具有預(yù)防和抵抗作用，對(duì)溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌和痢疾桿菌均有顯著的抑制作用[9-11]。現(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸應(yīng)用于食品行業(yè)可作為保健食品原料，具有天然的增香、護(hù)色、抗氧化作用[12]。

隨著科技的進(jìn)步，人們對(duì)天然植物提取物的研究與應(yīng)用需求越來(lái)越多。自然資源的浪費(fèi)和匱乏，使得未來(lái)的自然資源越來(lái)越稀缺，找到新的提取方法，減少提取過(guò)程中的浪費(fèi)，既有效利用自然資源，又能造福人類生活與健康，是未來(lái)發(fā)展的重要方向。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)羅漢果花的研究報(bào)道較少，尤其對(duì)羅漢果花中綠原酸的研究還未見文獻(xiàn)報(bào)道。為了更好地開發(fā)利用羅漢果花，擬通過(guò)篩選提取溶劑和提取方法，并對(duì)羅漢果花綠原酸的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化及其體外抗氧化性進(jìn)行測(cè)定，為羅漢果花綠原酸的生產(chǎn)開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

羅漢果花（桂林市山植農(nóng)副產(chǎn)品有限公司）：試驗(yàn)前于烘箱中45 ℃恒溫烘干至恒重后粉碎，裝于密封袋中備用。

無(wú)水乙醇、聚乙二醇、DPPH·（1, 1-二苯基-2-苦基肼自由基）：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海科順生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

752N紫外可見分光光度計(jì)，上海屹譜儀器有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；M1-L213B白色美的微波爐，廣東美的廚房電器制造有限公司；FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

根據(jù)文獻(xiàn)[13]，在326 nm下測(cè)定吸光度，以吸光度y為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度x為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程：y=0.055 8x+0.011 4，回歸系數(shù)R2= 0.999 1。

1.3.2 綠原酸得率的計(jì)算

式中：y為樣品吸光度；N為樣品稀釋倍數(shù)；V為加入溶劑體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

紫外分光法測(cè)得的是綠原酸類物質(zhì)（含異構(gòu)體）總得率。

1.3.3 提取方法的比較

經(jīng)過(guò)查閱文獻(xiàn)，了解目前對(duì)不同原料中綠原酸的提取方法，如水浴法[14]、微波輔助法[15]、超聲輔助法[16]等。為了了解羅漢果花中綠原酸不同提取方法的提取效果，進(jìn)行3種提取方法的比較：分別準(zhǔn)確稱取3份1.00 g羅漢果花粉末樣品，置于3個(gè)250 mL具塞錐形瓶中，向樣品中加入100 mL 40%乙醇，1份于60 ℃水浴提取40 min；1份于60 ℃先水浴提取37 min，接著在微波功率350 W下加熱3 min；1份于60 ℃超聲波提取40 min。分別抽濾后將全部樣品轉(zhuǎn)入3個(gè)100 mL容量瓶中定容至刻度。各吸取1 mL上述液體稀釋到25 mL，在326 nm下測(cè)其吸光度，每組重復(fù)3次試驗(yàn)，取平均值計(jì)算綠原酸得率。

1.3.4 提取溶劑的選擇

在提取方法確定的基礎(chǔ)上，準(zhǔn)確稱取3份1.00 g羅漢果花粉末樣品，分別置于250 mL具塞錐形瓶中，向每組樣品中分別加入蒸餾水、40%乙醇、40%聚乙二醇，各100 mL，按確定的方法提取。抽濾后將全部樣品轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中定容至刻度。吸取1 mL上述液體稀釋到25 mL，在326 nm下測(cè)其吸光度，每組重復(fù)3次試驗(yàn)，取平均值計(jì)算綠原酸得率。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

分別準(zhǔn)確稱取5份一定量的羅漢果花粉末，放入5個(gè)錐形瓶中，按料液比1：25（g·mL-1）加入1.3.4確定的溶劑，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)和查閱相關(guān)文獻(xiàn)，其他條件不變，分別改變?nèi)軇w積分?jǐn)?shù)（20%，30%，40%，50%和60%）、料液比（1：15，1：20，1：25，1：30和1：35 g·mL-1）、提取時(shí)間（1，2，3，4和5 min）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定每個(gè)因素的最佳水平。

1.3.6 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以綠原酸得率為考察指標(biāo)，不考慮交互作用，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，確定最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素水平表見表1，試驗(yàn)結(jié)果采用極差分析和方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.7 提取液對(duì) DPPH·清除能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17-18]，并作修改。將提取液配制成含綠原酸質(zhì)量濃度分別為10，20，40，60，80和100 μg/mL的待測(cè)液，分別取2.0 mL含不同濃度綠原酸待測(cè)樣品溶液，加入2.0 mL 0.2 mmoL/L DPPH·乙醇溶液，混合均勻后避光放置30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定其吸光度。以2.0 mL體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇代替樣品為空白；以2.0 mL待測(cè)樣品與2.0 mL體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇混合液為樣品對(duì)照，以消除樣品本身顏色的影響。DPPH·清除率按式（2）計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對(duì)提取液中綠原酸得率的影響

按照1.3.3的方法進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行分析處理并作圖，結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取方法對(duì)提取液綠原酸得率的影響

由圖1可知，在3種提取方法中，微波輔助提取法獲得的提取液中綠原酸得率最高，其次是超聲法，而水浴法獲得的綠原酸得率最低。原因可能是超聲輔助提取法與水浴法沒(méi)有提取到更多的綠原酸，而微波輔助提取效果更好可能是因?yàn)殡姶挪ù┩改芰Ρ容^強(qiáng)，而且具有容易控制、加熱迅速等特點(diǎn)，從而提取出更多的綠原酸。因此，以下試驗(yàn)均采用微波輔助法提取。

2.2 不同提取溶劑對(duì)提取液中綠原酸得率的影響

按照1.3.4的方法進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行分析處理并作圖，結(jié)果見圖2。

圖2 不同提取溶劑對(duì)提取液中綠原酸得率的影響

由圖2可以看出，對(duì)于選擇的三種提取劑來(lái)說(shuō)，聚乙二醇的提取效果最好，蒸餾水提取效果次之，40%乙醇提取效果最差，這可能是因?yàn)榱_漢果花中綠原酸在聚乙二醇中的溶解度最大。因此，以下試驗(yàn)均采用聚乙二醇為溶劑來(lái)提取。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 不同聚乙二醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取液中綠原酸得率的影響

按照1.3.5方法，以聚乙二醇為溶劑，采用微波輔助提取方法，其他條件不變，分別改變?nèi)軇w積分?jǐn)?shù)（20%，30%，40%，50%和60%）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。

圖3 不同聚乙二醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取液中綠原酸得率的影響

由圖3可知，當(dāng)聚乙二醇體積分?jǐn)?shù)小于50%時(shí)，綠原酸得率隨著溶劑體積分?jǐn)?shù)的增加而增加；當(dāng)體積分?jǐn)?shù)超過(guò)50%以后，得率不再明顯增加。這是由于樣品中綠原酸的總量在溶解的過(guò)程中是恒定的，在溶劑體積分?jǐn)?shù)為50%處有最大得率，為1.32%，超過(guò)這個(gè)體積分?jǐn)?shù)，溶劑體積分?jǐn)?shù)再增加，溶解出的綠原酸也不會(huì)再有很大變化。因此，綜合考慮原料利用率等多種因素，聚乙二醇的最佳體積分?jǐn)?shù)為50%。

2.3.2 不同料液比對(duì)提取液中綠原酸得率的影響

按照1.3.5方法，以聚乙二醇為溶劑，采用微波輔助提取方法，其他條件不變，分別改變料液比（1：15，1：20，1：25，1：30和1：35 g·mL-1）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖4。

圖4 不同料液比對(duì)提取液中綠原酸得率的影響

由圖4可知，綠原酸得率隨著料液比的增加而增大，在料液比從1：15 g·mL-1增大至1：30 g·mL-1的過(guò)程中，綠原酸得率增加得較多；當(dāng)料液比超過(guò)1：30 g·mL-1時(shí)，隨著料液比的繼續(xù)增大，綠原酸得率增幅較小，趨于平緩，這可能是由于提取液中綠原酸已達(dá)到飽和所致，并且在綠原酸溶出的同時(shí)其他干擾成分也會(huì)溶出，進(jìn)而阻礙綠原酸溶出。綜合考慮后期的濃縮成本，因此，選擇1：30 g·mL-1為最適料液比。

2.3.3 不同微波提取時(shí)間對(duì)提取液中綠原酸得率的影響

按照1.3.5方法，以聚乙二醇為溶劑，采用微波輔助提取方法，其他條件不變，分別改變微波提取時(shí)間（1，2，3，4和5 min）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖5。

圖5 不同微波提取時(shí)間對(duì)提取液中綠原酸得率的影響

由圖5可知，在1～4 min時(shí)，綠原酸得率隨提取時(shí)間的增加而上升，4 min后隨提取時(shí)間的繼續(xù)增加而減少，且下降趨勢(shì)隨時(shí)間的增大而增大，故提取時(shí)間為4 min時(shí)綠原酸得率最高。提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能破壞了綠原酸的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致綠原酸得率反而降低。因此，選用4 min為最適提取時(shí)間。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按1.3.6的方法，以綠原酸得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，不考慮交互作用，試驗(yàn)結(jié)果采用極差分析和方差分析，正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果和方差分析結(jié)果分別見表2和表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

由表2可知，極差分析結(jié)果表明，影響羅漢果花提取液綠原酸得率的因素大小為溶劑體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞料液比。由表3方差分析結(jié)果可知，F(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)因素對(duì)綠原酸得率的影響均不顯著。究其原因可能是試驗(yàn)誤差大且誤差自由度小，使檢驗(yàn)的靈敏度低，從而掩蓋了考察因素的顯著性。由于各因素對(duì)綠原酸得率影響均不顯著，不必再進(jìn)行各因素水平間的多重比較。根據(jù)F值大小可知，影響綠原酸得率的因素大小順序與極差分析相同。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示利用羅漢果花提取綠原酸的最佳工藝條件為A2B3C3，與實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果A2B3C1不符，這可能是由于因素之間存在交互作用，也可能受到自然條件、人為因素、儀器精度等諸多因素影響。后經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證即將理論優(yōu)化組合A2B3C3與實(shí)際試驗(yàn)組合A2B3C1進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，理論優(yōu)化組合A2B3C3的綠原酸得率平均值為1.70%，實(shí)際試驗(yàn)組合A2B3C1的綠原酸得率平均值為1.66%，通過(guò)驗(yàn)證可知理論試驗(yàn)組合A2B3C3清除效果最好，即溶劑體積分?jǐn)?shù)為50%，提取時(shí)間為5 min，料液比為1：35 g·mL-1。在上述條件下，進(jìn)一步試驗(yàn)得到羅漢果花提取液中綠原酸得率達(dá)到1.70%。

2.5 提取液對(duì)DPPH·清除能力測(cè)定

按1.3.7的方法進(jìn)行試驗(yàn)，并與用綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、VC進(jìn)行比較，試驗(yàn)結(jié)果見圖6。由圖6可知，羅漢果花提取液、綠原酸和VC對(duì)DPPH·均有很好的清除作用。羅漢果花提取液和綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品在低濃度時(shí)對(duì)DPPH·清除效果均高于VC，且有一定的線性關(guān)系，且在40 μg/mL時(shí)對(duì)DPPH·清除率達(dá)到82%和79%。在低濃度時(shí)羅漢果花提取液對(duì)DPPH·清除率比綠原酸高可能與提取液中除了綠原酸外還有黃酮類等其他活性物質(zhì)有關(guān)；當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)60 μg/mL時(shí)，兩者清除能力相當(dāng)，結(jié)果表明提取液中主要抗氧化成分是綠原酸。

圖6 羅漢果花提取液、抗壞血酸和綠原酸對(duì)DPPH·自由基的清除率

3 結(jié)論與討論

微波輔助提取法具有快速高效、節(jié)省溶劑、有選擇性、節(jié)省時(shí)間、后處理方便等特點(diǎn)從而應(yīng)用得越來(lái)越廣泛。試驗(yàn)結(jié)果表明利用聚乙二醇作為溶劑，采用微波輔助提取羅漢果花中綠原酸具有較好的效果。結(jié)果顯示，在聚乙二醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1：35 g·mL-1、溫度60 ℃的條件下水浴提取37 min后，再在微波功率350 W下提取5 min，此時(shí)提取液中綠原酸得率最高，為1.70%；羅漢果花提取液中綠原酸具有較好的抗氧化能力，其在低濃度時(shí)對(duì)DPPH·清除能力高于VC，且在質(zhì)量濃度60 μg/mL時(shí)對(duì)DPPH·清除率達(dá)到87%，可以作為食品中的抗氧化劑進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)利用。考慮到綠原酸在高溫下容易受到破壞，故提取時(shí)通過(guò)查閱文獻(xiàn)綜合考慮微波提取功率為350 W，未進(jìn)行微波功率的變化試驗(yàn)；另外因時(shí)間和篇幅的限制，未對(duì)羅漢果花綠原酸的提純優(yōu)化及其他生理功能的研究，未來(lái)有待于進(jìn)一步的研究。