響應(yīng)曲面法優(yōu)化聯(lián)合提取結(jié)球紅菊苣中菊苣酸和香豆素

王一婷，朱建星*，劉佳欣，賀夢(mèng)瑤，張萬(wàn)忠

沈陽(yáng)化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院（沈陽(yáng) 110142）

結(jié)球紅菊苣（Cichoricum intybusL. var.foliosumHegi.）是野生菊苣（Cichorium intybusL.）的變種，又名紅菊苣、白菊苣等，為菊科菊苣屬多年生草本植物[1-2]。菊苣中主要含有菊苣酸等多種活性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)菊苣粗提物具有清肝利膽、降血脂、降血糖、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[3]，菊苣中含有的菊苣酸、香豆素含量較為豐富且極性相近，但關(guān)于結(jié)球紅菊苣中的菊苣酸、香豆素聯(lián)合提取的研究報(bào)道比較少見(jiàn)[4]。作為一種高效綠色提取技術(shù)，復(fù)合酶解法提取效率高，不容易引入其他的雜質(zhì)，而且不影響組織結(jié)構(gòu)及目標(biāo)物質(zhì)的生物活性，成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)[5]。以乙醇溶液為酶解反應(yīng)溶劑，采用纖維素酶和果膠酶處理菊苣粉末的酶解工藝，對(duì)結(jié)球紅菊苣中菊苣酸、香豆素進(jìn)行聯(lián)合提取，為結(jié)球紅菊苣活性成分提取工藝的綜合應(yīng)用和菊苣的功能性食品開(kāi)發(fā)及大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)[6-9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

結(jié)球紅菊苣（市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)）；無(wú)水乙醇（分析純，天津市博迪化工股份有限公司）；纖維素酶（＞15 000 U/g，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；果膠酶（＞15 000 U/g，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；菊苣酸對(duì)照品（純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司）；秦皮乙素對(duì)照品（純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司）。

ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；高效液相色譜（安捷倫1200）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Synergy HTX美國(guó)伯騰儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料的預(yù)處理

取適量的結(jié)球菊苣，用吹風(fēng)除塵后，干燥后磨粉過(guò)孔徑0.425 mm篩，真空干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及結(jié)球菊苣菊苣酸、香豆素含量測(cè)定

菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：準(zhǔn)確稱取菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)品配制質(zhì)量濃度為2.00，3.33，5.00，6.25，8.33，10.00，12.50，16.67和25.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，用酶標(biāo)儀在326 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以菊苣酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為Y=0.045 6x-0.049 8（R2=0.999 7）。通過(guò)樣品提取液測(cè)得的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)對(duì)應(yīng)出相應(yīng)菊苣酸含量，計(jì)算出對(duì)應(yīng)的1 g紅菊苣粉中的菊苣酸得率。菊苣酸提取得率的計(jì)算如式（1）。

式中：m為所測(cè)定溶液的菊苣酸質(zhì)量，μg；V1為所取待測(cè)液體積；V為提取稀釋液總體積；M為樣品質(zhì)量，g。

香豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：準(zhǔn)確稱取秦皮乙素標(biāo)準(zhǔn)品配制質(zhì)量濃度為1.76，5.28，10.56，14.08，17.6，21.12和26.4 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，用酶標(biāo)儀在345 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以香豆素濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為Y=0.049 5x-0.011 8（R2=0.999 6）。通過(guò)樣品提取液測(cè)得的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)對(duì)應(yīng)出相應(yīng)香豆素的含量，計(jì)算出對(duì)應(yīng)的1 g紅菊苣粉中的香豆素得率。香豆素提取得率的計(jì)算如式（2）。

式中：m為所測(cè)定溶液的香豆素質(zhì)量，μg；V1為所取待測(cè)液體積；V為提取稀釋液總體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 酶解過(guò)程單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菊苣酸、香豆素提取得率的影響

稱取1 g菊苣粉末5份，加入1 mL纖維素酶+果膠酶為2+0.4 mg的酶液，以料液比1︰25（g/mL），分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0，20%，40%，55%，60%，65%，70%和75%的乙醇。于55 ℃振蕩，40 min。水浴85 ℃滅酶，將反應(yīng)液抽濾。取濾液稀釋100倍，用酶標(biāo)儀測(cè)定菊苣酸、香豆素含量，計(jì)算提取得率。

1.2.3.2 加酶量（纖維素酶+果膠酶）對(duì)菊苣酸、香豆素提取得率的影響

稱取1 g菊苣粉末5份，加入1 mL纖維素酶+果膠酶分別為0，0.5+0.1，1+0.2，2+0.4和3+0.6 mg的酶液，以料液比1︰25（g/mL）加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%乙醇，55℃振蕩40 min。后續(xù)操作同1.2.3.1。

1.2.3.3 提取時(shí)間對(duì)菊苣酸、香豆素提取得率的影響

稱取1 g菊苣粉末5份，加入1 mL纖維素酶+果膠酶為2+0.4 mg的酶液，以料液比1︰25（g/mL）加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%乙醇。于55 ℃振蕩20，30，40，50和60 min。后續(xù)操作同1.2.3.1。

1.2.3.4 提取溫度對(duì)菊苣酸、香豆素提取得率的影響

稱取1 g菊苣粉末5份，加入1 mL纖維素酶+果膠酶為2+0.4 mg的酶液，分別加入料液比1︰25（g/mL）的65%乙醇。分別在40，45，50，55和60 ℃，振蕩40 min，后續(xù)操作同1.2.3.1。

1.2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

為優(yōu)化提取工藝設(shè)計(jì)，根據(jù)單因素試驗(yàn)對(duì)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、加酶量（纖維素酶+果膠酶）（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）確定最佳條件，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面分析，分別用-1、0和1代表不同水平，以菊苣酸、香豆素提取得率作為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)并建立數(shù)學(xué)模型。各試驗(yàn)因素與水平的設(shè)計(jì)如表1所示。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)3次，采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

表1 響應(yīng)面因素設(shè)計(jì)水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 提取菊苣酸、香豆素的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菊苣酸、香豆素提取得率的影響

乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菊苣酸、香豆素提取得率的影響見(jiàn)圖1。與不加乙醇的水體系（乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%）相比，在乙醇溶液體系中的纖維素酶和果膠酶有更大的酶促水解效率，酶對(duì)細(xì)胞壁的水解和乙醇溶液對(duì)菊苣總苷類物質(zhì)的浸出產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)[3]。使用水體系時(shí)，菊苣酸、香豆素提取得率均較低，而采用乙醇溶液水解體系可獲得更高的提取得率。隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，菊苣酸、香豆素的提取得率也在增大，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%時(shí)，提取得率最大，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于65%時(shí)，提取得率下降，所以確定最優(yōu)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%，此條件下的提取得率比水體系中的提取得率高38%以上。

2.1.2 加酶量（纖維素酶+果膠酶）對(duì)菊苣酸、香豆素提取得率的影響

加酶量對(duì)菊苣酸、香豆素提取得率的影響見(jiàn)圖2。與不加酶相比，添加復(fù)合酶制劑明顯提高菊苣酸和香豆素提取得率，分別提高36%和31.7%。提取得率隨加酶量增大而逐漸增大，每克菊苣粉末加入2.0mg纖維素酶、0.4 mg果膠酶時(shí)，菊苣酸和香豆素的提取得率最大，但繼續(xù)增加酶用量，反而導(dǎo)致提取得率出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)檩^多的酶黏附于菊苣細(xì)胞壁上，不利于菊苣酸、香豆素類化合物向溶劑中擴(kuò)散。

圖1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菊苣酸、香豆素提取得率的影響

圖2 加酶量（纖維素酶+果膠酶）對(duì)菊苣酸、香豆素提取工藝的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)菊苣酸、香豆素提取得率的影響

提取時(shí)間對(duì)菊苣酸、香豆素提取得率的影響見(jiàn)圖3。隨著提取時(shí)間增長(zhǎng)，菊苣酸、香豆素提取得率增大，40 min時(shí)提取得率達(dá)到最大，提取時(shí)間40 min后提取得率便下降，這是因?yàn)樘崛r(shí)間會(huì)直接影響有效成分的浸出，提取時(shí)間過(guò)短有效成分還沒(méi)有充分反應(yīng)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致有效成分降解，所以確定最優(yōu)提取時(shí)間為40 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)菊苣酸、香豆素提取工藝的影響

2.1.4 提取溫度對(duì)菊苣酸、香豆素提取工藝的影響

提取溫度對(duì)菊苣酸、香豆素提取工藝的影響見(jiàn)圖4。隨著提取溫度增大提取得率不斷升高，在50 ℃時(shí)達(dá)到最高，55 ℃以上提取得率有所下降，這是因?yàn)闇囟葧?huì)增強(qiáng)細(xì)胞的透性，有利于內(nèi)容物的有效浸出，但溫度過(guò)高時(shí)會(huì)使菊苣酸、香豆素分解導(dǎo)致其提取得率下降，所以確定最優(yōu)提取溫度為50 ℃。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件（表2）進(jìn)行回歸擬合得到菊苣酸（Y1）、香豆素提取率（Y2）與提取因素乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、酶量（B）、時(shí)間（C）、溫度（D）之間的二次多元回歸方程為Y1=3.41-0.018A+0.030B+0.063C+0.024D+0.008 5AB+0.17AC-0.042AD-0.028BC-0.14BD+0.097CD-0.65A2-0.40B2-0.36C2-0.11D2；Y2=2.38-0.001 917A+0.041B+0.049C+0.009 833D+0.019AB+0.12AC-0.016AD+0.016BC-0.12BD+0.066CD-0.62A2-0.30B2-0.26C2-0.11D2。

圖4 提取溫度對(duì)菊苣酸、香豆素提取工藝的影響

表2 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3所示的方差分析數(shù)據(jù)可知，模型F=37.3，p＜0.000 1，表明模型對(duì)提取工藝達(dá)到極顯著，CV=3.11%，R2adj=0.947 8，R2=0.973 9，證明模型擬合度良好，試驗(yàn)誤差小，可以應(yīng)用于響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取結(jié)球菊苣菊苣酸。根據(jù)各因素的顯著性檢驗(yàn)p值的大小可以看出，各因素對(duì)菊苣酸提取工藝的影響大小為提取時(shí)間＞加酶量（纖維素酶+果膠酶）＞提取溫度＞乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表3 菊苣酸提取率回歸方程方差分析表

由表4所示的方差分析數(shù)據(jù)可知，模型F=52.88，p＜0.000 1，CV=3.45%，R2adj=0.962 9，R2=0.981 4，證明模型的擬合度良好，試驗(yàn)誤差小，可應(yīng)用于響應(yīng)曲面法優(yōu)化的提取結(jié)球菊苣香豆素。根據(jù)各因素的顯著性檢驗(yàn)p值的大小可以看出，各因素對(duì)香豆素提取工藝的影響大小為提取時(shí)間＞加酶量（纖維素酶+果膠酶）＞提取溫度＞乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表4 香豆素提取率回歸方程方差分析表

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析

響應(yīng)曲面圖可以更直觀的反映各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。將A、B、C、D中任意2個(gè)因素與菊苣酸提取得率合為三維曲面圖，分析比較圖5的兩兩交互作用可知乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和時(shí)間、酶量和溫度、時(shí)間和溫度交互作用影響較大。

圖5 各因素交互作用對(duì)菊苣酸得率影響的響應(yīng)面圖

圖6 各因素交互作用對(duì)香豆素得率影響的響應(yīng)面圖

將A、B、C、D中任意2個(gè)因素與香豆素提取得率合為三維曲面圖，分析比較圖6的兩兩交互作用可知，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和時(shí)間、酶量和溫度、時(shí)間和溫度交互作用影響較大。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝結(jié)球紅菊苣各因素的最優(yōu)值為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)65.04%，每克菊苣粉末加酶量（纖維素酶+果膠酶）2.04+0.408 mg、提取時(shí)間42.06min、提取溫度55.91 ℃。為方便試驗(yàn)操作將條件修正為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%，加酶量（纖維素酶+果膠酶）2+0.4 mg，時(shí)間42 min，溫度56 ℃。在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，菊苣酸提取得率為3.471%，3.467%和3.472%，平均提取得率為3.47%，香豆素提取得率為2.437%，2.441%和2.445%，平均提取得率為2.44%，與理論值基本吻合。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以結(jié)球紅菊苣為原料采用復(fù)合酶（纖維素酶+果膠酶）聯(lián)合水解提取菊苣酸、香豆素，并通過(guò)設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面法進(jìn)行試驗(yàn)分析及優(yōu)化，確定最優(yōu)提取工藝條件為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%、每克菊苣粉末加酶量（纖維素酶+果膠酶）2 mg+0.4 mg、提取時(shí)間42 min、提取溫度56 ℃，菊苣酸提取得率為3.47%，香豆素提取得率為2.44%，與模型預(yù)測(cè)的提取得率相差誤差較小，模型與實(shí)際結(jié)果相吻合。因此，利用設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面法優(yōu)化對(duì)結(jié)球菊苣菊苣酸、香豆素提取的聯(lián)合提取工藝是科學(xué)可行的，與不加酶的提取工藝相比，采用乙醇溶液體系添加復(fù)合酶制劑的提取工藝明顯提高菊苣酸和香豆素的提取得率，分別提高36%和31.7%，且更快速和環(huán)保。