水力空化在不同pH下對大豆β-伴球蛋白理化性質的影響

馬瑩瑩，任仙娥*，李春枝，楊鋒，黃永春，閻柳娟

廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西高校糖資源加工重點實驗室（柳州 545006）

大豆蛋白氨基酸組成合理，并具有良好的加工性能以及較低的成本，常作為重要的食品配料被廣泛應用于食品行業。大豆蛋白的主要成分為11S（大豆球蛋白）和7S（β-伴球蛋白），其中β-伴球蛋白是一種糖蛋白，具有三聚體的分子結構，由α’-、α-和β-這3個亞基組成。大豆蛋白經過適當修飾改性后可獲得更好的功能性質，滿足不同類型食品體系的需求[1]。蛋白質改性方法有物理改性和化學改性等方法，物理改性是通過改變蛋白質的高級結構和分子間聚集方式使蛋白質發生改性，具有無毒副作用、安全性高及對產品營養性質影響較小等優點而被廣泛使用。空化技術作為近些年應用在食品加工中的新的物理方法，引起國內外很多學者的關注。

水力空化作為一種新興技術，具有和超聲空化相似的空化效應，在食品蛋白方面已有很多學者研究。Gregersen等[2]、Li等[3]的研究表明水力空化技術可降低牛奶蛋白濃縮物黏度，從而提高噴霧干燥效率，降低乳制品粉末的生產成本。Meletharayil等[4]研究發現水力空化可改善希臘酸奶的流變特性和微觀結構。Pathania等[5]發現水力空化提高難以溶解的高蛋白奶粉再水化性能。可見，水力空化技術在一定條件下能改變食品蛋白質的理化性質，進而改善其產品品質。前期研究發現單孔孔板水力空化可使大豆球蛋白的平均粒徑、暴露巰基含量和總巰基含量均減小，Zeta電位絕對值和表面疏水性均增加[6]。試驗進一步研究水力空化處理對大豆蛋白中另一組分——大豆β-伴球蛋白理化性質的影響，為該技術應用于大豆蛋白改性提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粕（益海嘉里（防城港）有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA二鈉，西隴化工股份有限公司）；1-苯胺-8-萘磺酸（ANS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS，天津市大茂化學試劑廠）；5, 5’二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB，國藥集團化工試劑有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（天津市科密歐化學試劑有限公司）；福林酚（上海源葉生物有限公司）。其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

T6新世紀紫外-可見分光光度計（上海圣科儀器設備有限公司）；F97Pro型熒光分光光度計（天津港東科技發展股份有限公司）；Avanti J-26 XPI高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；Nano ZS90馬爾文納米粒度和Zeta電位分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；T25高剪切混合乳化機（上海鑫鯊機械設備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆β-伴球蛋白的制備

參照Nagano等[7]的方法稍作修改。脫脂豆粕經過粉碎后，用0.180 mm直徑的篩子過篩，得到脫脂大豆粉。稱取120 g豆粕粉并將其充分溶解于1.8 L去離子水中，用2 mol/L NaOH溶液將pH調至8.0。室溫低速攪拌2 h，離心（9 000g，10 min，4 ℃）棄沉淀，保留上清液。向上清液中加入NaHSO3（0.01 mol/L），充分溶解后用2 mol/L HCl溶液調pH 6.4。將所得料液放置于4 ℃的冰箱內冷藏，靜置過夜后離心（9 000g，10 min，4 ℃），得沉淀大豆球蛋白（11S），向上清液中加入CaCl2固體（0.01 mol/L），充分溶解后用2 mol/L HCl溶液將pH調至5.0。將調好后的料液放入已加熱至45 ℃水浴鍋中靜置保溫30 min，保溫結束后將料液溫度降至25 ℃左右，用2 mol/L NaOH溶液調pH 5.5。離心（9 000g，10 min，4 ℃）取上清液，上清液加等體積的去離子水（體積比1︰1），攪拌均勻后用2 mol/L HCl溶液調pH 4.8。在室溫下靜置2 h后離心（6 500g，10 min，4 ℃），所得沉淀即為大豆β-伴球蛋白。向大豆β-伴球蛋白沉淀中加入少量去離子水溶解，用2 mol/L NaOH溶液調pH 7.0，充分攪拌溶解。裝入經過處理的透析袋中，放于4 ℃冰箱透析48 h，透析液經真空冷凍干燥后裝入密封袋，放置冰箱凍藏備用。

1.3.2 水力空化處理不同pH大豆β-伴球蛋白

將大豆β-伴球蛋白配成4份質量分數為3%的分散液于1 000 mL燒杯中，分別調pH至3，5，7和9，取800 mL倒入水力空化裝置的貯罐中，空化裝置圖同文獻[6]，啟動裝置，開啟冷凝水使大豆β-伴球蛋白在整個處理過程中溫度不超過35 ℃，處理不同時間（0，10和30 min）后取樣測定其理化指標，每個指標測3次。

1.3.3 粒徑和Zeta電位的測定

將空化處理后的蛋白質離心（10 000 r/min，10 min，4 ℃）后稀釋至3 mg/mL，用0.45 μm的濾膜在室溫下采用納米粒度儀測定各樣品的粒徑。再取樣品測定其Zeta電位。測定條件：1 cm聚苯乙烯池，一對0.45 cm2鉑電極，間距0.4 cm，測定溫度25 ℃，平衡時間2 min。

1.3.4 表面疏水性的測定

參照Voutsinas等[8]的方法，以ANS為熒光探針，將蛋白樣品用0.2 mol/L、pH 8.0的磷酸鹽緩沖液稀釋至不同質量濃度（0.005～0.5 mg/mL），取4 mL樣品，加入10 μL 8 mmol/L ANS溶液，混合均勻后，在熒光分光光度計下進行測定。設定激發波長370 nm、發射波長490 nm、狹縫寬5 nm。以熒光強度對蛋白質量濃度作圖并進行線性回歸，以線性回歸斜率作為蛋白質的表面疏水性。

1.3.5 乳化性的測定

參考楊盛楠等[9]方法稍作修改。將蛋白樣品稀釋至3 mg/mL，取15 mL蛋白溶液，加入5 mL玉米油，在試管中加入5 mL的1 mg/mL的SDS備用，將蛋白溶液在均質機下進行均質分散1 min，轉速10 000 r/min。均質停止時直接從底部吸取50 μL的乳濁液加入到裝有SDS溶液的試管中，并將其充分混勻。靜置10 min之后再從均質后的樣液的底部吸取50 μL加入到另一支裝有SDS溶液的試管中，使用紫外可見分光光度計在500 nm處測定吸光度。靜置前后所測得的吸光度用A0、A10表示。以SDS溶液作為空白對照。乳化活性指數（EAI，m2/g）和乳化穩定性（ESI，min）分別按式（1）和（2）計算。

式中：θ為用于形成乳液所用油相在溶液中所占體積比；C為蛋白質濃度，g/mL；L為比色皿的厚度；DF為稀釋倍數；A0為均質停止時取樣測定的吸光度；A10為靜置10 min后取樣測定的吸光度。

2 結果與分析

2.1 粒徑分布

大豆β-伴球蛋白在不同pH下的粒徑分布如圖1（A）所示。在所試pH下均呈多峰分布，其中在pH 5時有4個峰，1～100 nm處現3個峰，100～1 000 nm處1個峰；pH 3時有3個峰，分別在10～100，100～1 000和1 000～10 000 nm；pH 7和9時呈雙峰分布。由圖2可知，在pH 5時，平均粒徑最大，為213.07±4.24 nm；pH 7和9時，平均粒徑較小，分別為（18.30±4.41）nm和（15.11±0.22）nm。因為在溶液pH接近等電點（pI=4.8）時，分子間靜電斥力降低，發生聚集，所以平均粒徑較高。

由圖1（B）可知，大豆β-伴球蛋白在pH 3時，水力空化處理后1 000～10 000 nm處的峰消失，10～100 nm處的峰向左偏移。pH 5時，處理后的粒徑分布如圖1（C）所示，100～1 000 nm處的峰均向左偏移，且處理30 min后在1 000～10 000 nm出現一個峰。從圖1（D）中可知，pH 7時水力空化處理對蛋白的粒徑分布無影響。pH 9時粒徑分布圖如1（E）所示，經水力空化處理后10～100 nm處的峰強度增加，粒徑分布變窄。由圖2可知，pH 5時，其平均粒徑隨空化處理時間顯著減小（p＜0.05），處理30 min后蛋白的平均粒徑從（213.067±4.25）nm減小到（96.9±0.74）nm，這可能是由于空化效應，產生湍流和高剪切力，破壞蛋白分子間相互作用，大豆β-伴球蛋白的大聚集體逐漸被解離成小聚集體，從而導致平均粒徑顯著減小。王芳等[6]的研究結果表明單孔孔板水力空化處理可顯著降低大豆球蛋白的平均粒徑，處理30 min后大豆球蛋白的平均粒徑由（335.67±3.43）nm減小至（234.73±4.32）nm。Hu等[10]的研究結果表明高強度超聲處理40 min，7S球蛋白的平均粒徑從75.9 nm減小到51.8 nm。由此說明水力空化和超聲空化等物理改性具有相似的效果，均能引起蛋白質分子中聚集體的解離，從而導致其平均粒徑減小。而在pH 3，7和9時，水力空化處理并未引起大豆β-伴球蛋白平均粒徑發生顯著變化（p＞0.05）。

圖1 水力空化對不同pH大豆β-伴球蛋白粒徑分布的影響

2.2 Zeta電位

蛋白質的Zeta電位可以通過蛋白質表面電荷的分布來體現[11]。通常，蛋白質表面帶負電荷的氨基酸多于帶正電荷的氨基酸時，其Zeta電位為負值，反之則為正值。Zeta電位的絕對值越大，表明體系越穩定[12]。由圖3可知，pH 3時，電位為正值，說明在酸性條件下蛋白質表面帶正電荷的氨基酸多于帶負電荷的氨基酸。pH 5，7和9時電位為負值，且隨著pH的增加電位絕對值增大。

大豆β-伴球蛋白經水力空化處理后，其Zeta電位絕對值在pH 3和7時減小，pH 5和9時顯著增加（p＜0.05）。Zeta電位絕對值增加可能是經孔板水力空化處理后，蛋白質分子的結構在一定程度上被破壞，分子展開帶負電荷的氨基酸殘基更多被暴露于蛋白分子表面而導致的。pH 5時平均粒徑減小（圖2），聚集體發生解聚，更多帶負電荷的氨基酸殘基暴露出來，也使Zeta電位絕對值增加。Zeta電位絕對值減小是因為在pH 3和7時，經水力空化處理后蛋白發生輕微聚集，帶電荷的基團被掩埋導致Zeta電位絕對值減小。可見，水力空化處理后大豆β-伴球蛋白分子結構會發生改變。

圖2 水力空化在不同pH下對大豆β-伴球蛋白平均粒徑的影響

圖3 水力空化對不同pH大豆β-伴球蛋白Zeta電位的影響

2.3 表面疏水性

表面疏水性是衡量蛋白質功能性質的重要指標之一[13]，其大小是由疏水性基團暴露的程度決定的。如圖4所示，pH 5時，表面疏水性最低（456.35±16.81），這是因為大豆β-伴球蛋白在疏水相互作用下形成聚集體，圖2中pH 5時蛋白平均粒徑最大也可印證這點。在pH＞pI與pH＜pI時，大豆β-伴球蛋白的表面疏水性均顯著增加（p＜0.05），且pH 3時達到最大（1 944.71±150.16），說明遠離等電點時埋藏在蛋白分子內的疏水基團暴露出來，使表面疏水性增加。

大豆β-伴球蛋白在pH 3和9時經水力空化處理后，表面疏水性無顯著變化（p＞0.05），說明在pH 3和9時經水力空化處理后暴露到蛋白質表面的疏水性基團無明顯變化，從圖2也知pH 3和9的平均粒徑無顯著變化（p＞0.05）。pH 5和7時，水力空化處理10 min后表面疏水性顯著增加（p＜0.05），說明有較多的疏水基團暴露在蛋白質分子表面，導致蛋白質表面疏水性增加。這可能是因為空化泡潰滅的瞬間產生高溫、高壓和高剪切力等，破壞蛋白質的高級結構或者使大的聚集體解聚，導致蛋白分子之間形成的聚集體較少（圖2中平均粒徑減小可印證），進一步暴露出包埋在β-伴大豆球蛋白分子中的疏水殘基。圖3中電位的絕對值增加也說明聚集體發生解離后更多疏水性殘基暴露，導致表面疏水性增加。

圖4 水力空化對不同pH大豆β-伴球蛋白表面疏水性的影響

2.4 乳化性

評價蛋白質乳化性的方法有乳化活性和乳化穩定性等方法。水力空化對不同pH大豆β-伴球蛋白乳化活性與乳化穩定性的影響如圖5所示。由圖5（A）可知，大豆β-伴球蛋白在pH 5時乳化活性較小，為（7.52±0.41）m2/g，遠離等電點呈上升趨勢，這與表面疏水性變化趨勢一致（圖4）。這是因為在等電點附近蛋白平均粒徑最大（圖2），表面疏水性較低（圖4），蛋白難溶且靜電斥力減小，所以乳化活性較差，遠離等電點蛋白大的聚集體發生部分解聚，粒徑減小，疏水性基團暴露出來，蛋白親油性增強，宏觀表現為乳化活性升高[14]。

由圖5（A）可知，大豆β-伴球蛋白的乳化活性在pH 5，7和9時隨水力空化處理時間的延長而增加，在pH 7空化時間為30 min時達到最大（95.48±0.82 m2/g）。這是因為水力空化產生的空化效應使蛋白結構遭到破壞，蛋白分子的極性親水基團與非極性疏水基團暴露出來，親水性與親油性均增強，親水性與親油性達到一定程度的平衡時，蛋白質在油水界面具有較好的穩定性，表現為乳化活性增強[15]。從圖5（B）中可見，大豆β-伴球蛋白經水力空化處理后乳化穩定性在pH 3和5時呈下降趨勢，而在pH 7空化10 min與pH 9空化30 min后乳化穩定性增大。pH 3時的乳化穩定性較低，可能是此時的蛋白質粒徑比堿性條件下的粒徑大，粒子分布不均勻，導致穩定性降低。

圖5 水力空化對不同pH大豆β-伴球蛋白乳化性的影響

3 結論

大豆β-伴球蛋白的平均粒徑、Zeta電位、表面疏水性和乳化性等理化性質隨著pH的改變而不同。水力空化處理在試驗所試pH下均可使其理化性質發生變化，變化程度與其所處的pH有關，以pH 5和7時較為明顯。可見，水力空化協同pH處理對大豆β-伴球蛋白的改性具有一定效果，這對將水力空化技術應用到大豆蛋白的生產中有一定意義。關于水力空化在不同pH下對大豆β-伴球蛋白的二級結構以及起泡性、凝膠性等功能性質的影響有待進一步研究。