UPLC-MS/MS同時測定14種藥食同源動物性食品中4種甾體激素

曹曉琴，方振峰，張濤，施璐*

江漢大學醫學院（武漢 430056）

藥食保健證實對人體具有治療、保健和“治未病”的效用[1]。2015年《101種藥食同源名單》中含藥食同源動物食品共14種被廣泛使用[2]，近年來食用藥食同源動物食療保健發展成為一種保健飲食經濟服務產業[3-4]，這對監管提出更高要求[5]。GB 31650—2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》規定267種（類）獸藥在畜禽產品、水產品、蜂產品中2

191項殘留限量及使用要求[6]。其中，雄激素家族中的諾龍[7-8]、雌激素中的己烯雌酚[9-10]、糖皮質激素中的氫化可的松[11-12]和孕激素中的醋酸氯地孕酮[13]是4種方便易得、易被養殖業廣泛添加的代表性激素。但試驗證明，其具有潛在致癌性[14-15]。

對藥食同源動物性食品多激素殘留檢測，國家暫未制定標準檢測方法。文獻報道的檢測方法主要有氣相色譜法（GC法）[16]、高效液相色譜法（HPLC法）[17-18]、氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS法）[19-21]和液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS/MS法）[22-24]。其中，HPLC-MS/MS法是激素測定最重要方法[25-28]。

試驗將TLC法應用到樣品前處理過程中，聯用高靈敏度、高專一性的UPLC-MS/MS法，建立同時檢測14種藥食同源動物性食品中4種不同類別的激素的UPLC-MS/MS方法。對14種藥食同源動物性食品進行檢測，為打擊非法飼喂、保障藥食同源動物性食品安全提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

諾龍（純度99.5%）、己烯雌酚（純度99.6%）（德國Dr. Ehrenstorfer公司）；氫化可的松（純度99.6%）、醋酸氯地孕酮（純度99.7%）（中國獸醫藥品檢查所）。

烏梢蛇、阿膠、雞內金、蝮蛇、蜂膠、蛤蚧、牡蠣、鱉甲、馬鹿胎、馬鹿茸、馬鹿骨、龜甲、珍珠等藥食同源動物性食品（武漢中醫院門診藥房）；蜂蜜（市售）。

甲醇、乙腈（色譜純）；其他試劑均為分析純；GF254薄層硅膠板（200 mm×100 mm，青島海浪硅膠干燥劑廠）。

1.2 儀器與設備

API 4500三重四極桿MS/MS（美國Applied Biosystems公司）；UPLC（日本島津公司）；分析天平（感量0.000 01 g，日本島津公司）；高速冷凍離心機（日本日立公司）；MILLI-Q超純水機（美國MILLIPORE公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

采用Kinetex 100 RP-18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），柱溫40 ℃；進樣體積10 μL；流速0.2 mL/min；流動相及梯度洗脫條件見表1。

表1 UPLC梯度洗脫程序

1.3.2 質譜條件

采用ESI源的正負離子同時掃描模式。主要參數：離子噴霧電壓4 500 V；離子源Gas1，0.36 MPa；Gas2，0.25 MPa；離子源溫度500 ℃；通過優化參數，得到的質譜參數見表2。

表2 4種藥物在MRM模式下優化的質譜參數

1.3.3 供試品的制備

烏梢蛇、阿膠、雞內金、蝮蛇、蛤蚧、牡蠣、蜂膠、鱉甲、馬鹿胎、馬鹿茸、馬鹿骨、龜甲、珍珠等固體類藥食同源動物性食品分別隨機取同一批號藥材，各10 g，研細或粉碎作為試樣。

蜂膠軟膠囊：隨機取20粒同一批號的供試品，將內容物全部擠入1個離心管中，充分混勻后，作為試樣。

蜂蜜：隨機取3瓶同一批號的供試品作為試樣。

所有采集的樣品均采用建立的檢測方法進行空白基質的篩選，測定結果為無任何干擾峰的基質作為空白基質，用于樣品添加試驗。

1.3.4 前處理條件

TLC法在文獻[29]基礎上進行適當優化。取硅膠GF254薄層板備用。稱取約1.0 g的1.3.3小節處理好的試樣，置于10 mL離心管中，加入1 mL水浸潤后放置2 min，加入3 mL乙腈，超聲提取（功率143 W、頻率40 kHz）15 min，再離心5 min（4 000 r/min），將上清液轉入另一離心管中。殘渣加入3 mL乙腈重復提取1次，合并2次提取液，于50 ℃氮氣濃縮至1 mL，點于制備好的薄層板上，室溫晾干，將展開劑三氯甲烷-乙醚-甲醇-濃氨水（40︰3︰4︰1，V/V）置層析缸中預飽和30 min，將點好樣的薄層板放入層析缸中，在15 ℃避光條件下進行上行展開，取出、晾干，在254 nm紫外光燈下檢視定位，將薄層板上不同對照品對應的樣品顯色區域挖下來，放入1.5 mL EP管中，將挖下的薄層粉末連同EP管一同烘干后，用1 mL的甲醇溶解，超聲（功率143 W、頻率40 kHz）5 min，再以8 000 r/min離心5 min，取上清液，過濾膜上機檢測。

1.4 統計學分析

在優化條件和實際樣品測定時，平行試驗重復操作6次，采用SPSS 13.0（Chicago，IL，USA）統計軟件分析。基質效應通過t檢驗的方法來考察[30]。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的選擇

試驗顯示，己烯雌酚在負離子模式響應較高，這與文獻[31]報道一致。雌激素（己烯雌酚）具有羥基，呈現弱酸性，易脫氫在負離子模式下獲得[M-H]-的準分子離子峰，同時也產生[M+COOH]-、[M+Cl]-的準分子離子峰。文獻[32]分析[M+Cl]-可能來源于水中氯離子影響，[M+COOH]-則是由于流動相中甲酸引起的。試驗發現，雄激素（諾龍）、孕激素（醋酸氯地孕酮）均產生較強的準分子離子峰[M+H]+，部分化合物也存在較弱的[M+Na]+加合峰，這與文獻[32]報道也一致。但糖皮質激素類藥物（氫化可的松）在正、負離子模式下均可電離成多種形式，這與文獻[33]的報道一致，經過比對發現，在與其他藥物同時檢測時正離子模式響應高于負離子模式響應，所以氫化可的松選用正離子模式。試驗中的諾龍、醋酸氯地孕酮、氫化可的松均采用正離子模式，電離形成[M+H]+準分子離子；己烯雌酚采用負離子模式，電離形成[M-H]-準分子離子，最終的選擇結果見表2。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 流動相

圖1 阿膠空白樣品添加4種藥物離子流圖（1 μg/kg）

鑒于樣品基質成分復雜，考察不同梯度洗脫程序對色譜分離的影響。采用方案1（0 min，25% A相；15 min，90% A相）和方案2（0 min，35% A相；10 min，90% A相）時，待測物出峰時間較快，但是在實際樣品檢測時發現雜質與待測物共流出，無法分離。把梯度程序調緩，可使雜質在前面出峰，延后待測物出峰時間，才得以很好分離，所以梯度洗脫方案為：0 min，5% A相；5 min，50% B相；8 min，95% B相。4種激素在10 min內能較好區分。圖1為阿膠空白樣品中添加4種激素在最佳梯度洗脫程序時的提取離子流圖。

2.3 方法學考察

2.3.1 基質效應考察

采用t檢驗的方法來考察基質效應[30]，根據檢驗規定，若t（n-4）＞2.4，說明存在基質效應。經t檢驗方法考察，4種激素在不同基質中的t值均大于2.4。所以，采用基質匹配工作曲線進行定量。

2.3.2 檢出限、定量限及線性范圍

利用配制的空白樣品添加混合標準溶液繪制標準工作曲線，重復5次，添加質量濃度依次為0.5，1.0，10.0，50.0，100.0和500.0 μg/L。以信噪比S/N≥3為檢出限（LOD），以S/N≥10為定量限（LOQ）。4種藥物諾龍、己烯雌酚、氫化可的松和醋酸氯地孕酮的線性范圍、檢出限和定量限見表3。

表3 4種待測藥物的線性回歸方程、相關系數、檢出限及定量限

2.3.3 準確度和精密度測定

由于每種樣品都可以篩選出空白樣品，考慮到動物性樣品的差異性，依次進行14種樣品的4種激素添加回收試驗。各個樣品分別在3個濃度水平添加，每個濃度重復5次，連續5 d進行重復試驗。當諾龍、己烯雌酚、氫化可的松和醋酸氯地孕酮添加濃度為0.5～2.0 μg/kg時，它們分別在14種樣品中的回收率在68.2%～100.1%，變異系數≤16.1%。表4列舉阿膠、雞內金、蜂蜜等3種樣品中4種藥物的回收率和變異系數結果。

表4 阿膠、雞內金和蜂蜜中4種藥物的回收率和變異系數

2.4 樣品測定

取14份自購樣品，按1.3小節的制備方法制備并進樣測定，通過各物質的保留時間及定量監測離子對進行4種激素定性定量分析。結果表明，在蜂蜜和阿膠樣品中均檢測到氫化可的松的殘留（測得m/z=363.3），經帶入工作曲線定量計算，蜂蜜中其質量濃度為3.5 μg/L，阿膠中其質量濃度為2.8 μg/L，而其他樣品中均未檢出4種待測藥物。根據農業部235號公告[6]規定，氫化可的松暫未規定其最高殘留限量，允許在動物飼料中使用。因此，檢測的14份自購樣品均合格。結果表明，所建立的方法可應用于14種藥食同源動物性食品中的4種甾體激素的殘留檢測。

3 結論

建立UPLC-MS/MS法檢測14種藥食同源動物性食品中的4種甾體激素。通過前處理方法的選擇和優化，得出TLC提取分離的最佳工藝條件。根據方法學考察結果，該方法專屬性強，靈敏度高，可作為14種藥食同源動物性食品中獸藥殘留的有效檢測方法。