HPLC-MS/MS測定東革阿里及咖啡制品中寬纓酮

吳薇

上海旺旺食品集團(tuán)有限公司（上海 201103）

東革阿里（Tongkat Ali，即Eurycoma longifoliaJack）[1]為苦木科東革阿里（Eurycoma）屬植物，野生灌木，生長于赤道附近原始熱帶雨林潮濕的酸性砂質(zhì)土壤中[5]。主要原產(chǎn)地為東南亞國家，如馬來西亞、印度尼西亞、泰國、緬甸以及越南等地[2]。被當(dāng)作藥材，東革阿里使用的原植物有E.longi-folia，E.longifoliasubsp. Eglandulosa，Entomophthora apiculata以及Polyathia bullata等[6]。東革阿里對滋補強身，尤其是增強男性荷爾蒙方面，在動物與人類的反復(fù)臨床實驗均已獲得證實。它與燕窩、錫器一起并稱馬來西亞三大國寶[5-6]。東革阿里的藥用部分主要來源于根部，一般采集4～7歲的植物[1]。東革阿里除了可以改善男性性功能障礙外[4-5]，還具有抗癌[6,10]、糖尿病[10]、抗炎癥[3]、還能治療痛風(fēng)[8]等功效。隨著對東革阿里藥理作用研究的深入，新的藥理不斷被報道，東革阿里作為草藥的理念也越來越受消費者的青睞。在互聯(lián)網(wǎng)購物網(wǎng)站上，東革阿里藥草按照外觀顏色分類，可分為黃色東革阿里、黑色東革阿里和紅色東革阿里。也有以添加劑的形式添加到食品中，如飲料沖劑（咖啡）、糖果等。

東革阿里的主要成分為苦木素類化合物，其中的主要活性成分——寬纓酮（Eurycomanone，EN）是其中最具代表性的一種[7-14]。目前針對東革阿里中有效成分，主要以提取、純化、定性為主，定量方法較少，此次試驗建立了以寬纓酮為目標(biāo)物，使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，MRM模式定量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備

Agilent LC1100高效液相色譜（美國安捷倫公司）；SCIEX Qtrap 5500三重四極桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國丹納赫旗下品牌），配電噴霧離子源（ESI）；IKA TUBE-MILL100研磨機；XS205分析天平（美國梅特列-托利多）；ELGA Classic UV超純水機（英國ELGA）；LABOROTA4000減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph）；Sigma2-16P離心機（日本）；實驗篩（孔徑2.00 mm），回流裝置；加熱套。

1.1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

寬纓酮標(biāo)準(zhǔn)品：純度99.5%，CAS號84633-29-4，上海源葉生物科技有限公司，分子式為C20H24O9，相對分子質(zhì)量為408.4，分子結(jié)構(gòu)式見圖1[5,9]。

圖1 寬纓酮分子結(jié)構(gòu)式

乙醇（色譜純，CNW）；乙腈（色譜純，MECK）；試驗用水均為經(jīng)超純水機處理后的水（18.2 MΩ·cm）。

1.1.3 樣品

泰國采購的東革阿里（黑東革阿里、紅東革阿里、黃東革阿里）草藥；咖啡制品：天然草藥咖啡、東革阿里白咖啡糖（white coffee candy）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制

寬纓酮標(biāo)準(zhǔn)貯備液溶液（1 000 μg/mL）：稱取50mg（精確至0.1 mg）寬纓酮標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜級的甲醇定容至50 mL，混勻，置于-4 ℃下密封保存。

寬纓酮標(biāo)準(zhǔn)中間液（1 000 ng/mL）：吸取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用0.1%甲酸水溶液-乙腈（9：1，V/V）定容至100 mL，混勻。

寬纓酮標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：分別取0.01，0.1，0.25，0.5，1和2 mL寬纓酮標(biāo)準(zhǔn)中間液于10 mL容量瓶中，用0.1%甲酸水溶液-乙腈（9：1，V/V）定容至刻度，標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度為1，10，25，50，100和200 μg/L。

1.2.2 試樣的制備

東革阿里藥材經(jīng)初步粉碎后，再使用研磨機粉碎，過孔徑為2 mm的篩子，及時密封待用。

固體粉末樣品：經(jīng)混合均勻后，及時密封，避免吸潮。

1.2.3 試樣溶液的制備

東革阿里草藥：稱取2.5 g的東革阿里草藥，分別用100 mL 75%乙醇溶液冷凝回流提取3次，每次2 h，過濾提取液，合并濾液并定容至500 mL，以7 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋25倍，過0.22 μm針式濾膜，上機測定。

咖啡制品：取1 g樣品，用熱水溶解，超聲20 min，冷卻定容至25 mL，以7 000 r/min離心10 min，過0.22μm針式濾膜，上機測定。

1.2.4 分析條件

1.2.4.1 色譜條件

色譜柱，Phenomenex Kinetex C18柱（2.1 mm×100mm，2.6 μm）；柱溫，35 ℃；進(jìn)樣體積，5 μL；流速，200 μL/min；流動相見表1。

表1 流動相配比及梯度洗脫時間

1.2.4.2 質(zhì)譜條件

ESI離子源，采用正離子檢測模式；氣簾氣（CUR），35 psi；離子化電壓（IS），5 500 V；離子化溫度（TEM），500 ℃；噴霧器（GS1），50 psi；輔助加熱氣（GS2），50 psi；碰撞電壓（CE），14 V；去簇電壓（DP），80 V。監(jiān)測模式，MRM；檢測離子對，409.2/391.2；外標(biāo)法定量。

圖2 寬纓酮標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

圖3 樣品圖譜

2 結(jié)果與討論

2.1 東革阿里草藥及咖啡制品中寬纓酮檢測結(jié)果（見表2）

表2 東革阿里草藥及咖啡制品檢測結(jié)果

2.2 試驗條件的選擇

2.2.1 色譜條件的探討

當(dāng)流速為400 μL/min，流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈（1：1，V/V）時，在樣品分析時發(fā)現(xiàn)寬纓酮抑制嚴(yán)重，存在基質(zhì)干擾，無法用于樣品測定，見圖4。1.2.3.1色譜條件中的流動相能成功將基質(zhì)與目標(biāo)物質(zhì)分離，避免基質(zhì)干擾抑制效應(yīng)，故被選用。

圖4 寬纓酮抑制圖

2.2.2 提取溶劑選擇

由于寬纓酮溶于水和乙醇溶劑，故對水、乙醇及其混合溶劑進(jìn)行考察。提取劑的選擇為純水、30%乙醇、75%乙醇和100%乙醇。取2.5 g藥材，用100 mL提取劑進(jìn)行加熱回流3次，每次2 h，過濾提取液，合并濾液，定容至500 mL，以7 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋25倍，進(jìn)3針，以平均峰面積計，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示提取溶劑選擇75%乙醇為宜。

表3 不同溶劑提取效率

2.2.3 提取次數(shù)的選擇

用75%乙醇溶液對提取次數(shù)進(jìn)行考察。取2.5 g藥材，用100 mL提取劑進(jìn)行加熱回流1，2和3次，每次2h，過濾提取液，合并濾液，定容至500 mL，以7 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋25倍，進(jìn)3針，以平均峰面積計，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，提取2次和3次的結(jié)果幾乎一致，故采用提取3次，以確保提取完全。

表4 不同次數(shù)提取效率

2.2.4 離子對的確定

在50～450 Da之間，尋找子離子過程中只發(fā)現(xiàn)409.2和391.2 Da，從分子質(zhì)量推測為失去1個水分子（18 Da），而18 Da不在監(jiān)測范圍內(nèi)，故確定寬纓酮的監(jiān)測離子對：409.2/391.2。

2.3 線性范圍

分別取標(biāo)準(zhǔn)使用液測其峰面積，含量及峰面積的結(jié)果見表5。線性方程為Y=3.311 65×104X+5.500 511×104，寬纓酮在1.0～200.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度和峰面積有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 35，權(quán)重為1/x2。

表5 標(biāo)準(zhǔn)使用液質(zhì)量濃度及峰面積結(jié)果

2.4 檢出限及定量限

以咖啡制品為基質(zhì)，分別取10個樣品進(jìn)行測定，其檢出限（S/N≥3）為0.01 mg/kg，定量限（S/N≥10）為0.025 mg/kg。

2.5 回收率試驗和精密度試驗

取東革阿里藥材，按照樣品前處理進(jìn)行處理，選擇3個添加水平，每個水平重復(fù)測定6次（n=6），其回收率結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，水平1（1 mg/kg），平均回收率為84.8%，δRSD為3.69%；水平2（10 mg/kg），平均回收率為93.5%，δRSD為2.82%；水平3（100 mg/kg），平均回收率為97.1%，δRSD為0.80%，能滿足定量檢測的要求。

表6 樣品回收率及精密度表

3 結(jié)論

目前，關(guān)于東革阿里文獻(xiàn)主要是功效研究和成分鑒定，在定量測定方面暫無標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)。故此次研究通過建立高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式，對東革阿里草藥和咖啡制品中主要活性成分寬纓酮進(jìn)行定量分析。對方法中涉及的前處理方式和色譜條件進(jìn)行探討。此方法前處理簡單、重現(xiàn)性好，可用于含量測定，同時為東革阿里的真?zhèn)舞b別及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。