小麥粉中2種新型真菌毒素含量測定方法

周貽兵，李磊，吳玉田，劉利亞*

貴州省疾病預防控制中心（貴陽 550004）

真菌毒素是農產品的主要污染物質之一，且隨著氣候變化，產毒真菌譜及真菌毒素發生顯著變化，新興真菌毒素不斷被發現，成為世界各國高度關注的食品安全熱點問題[1]。新興真菌毒素白僵菌素（BEA）和恩鐮孢菌素B（ENB）是由鐮刀菌屬真菌侵染小麥、玉米等農作物后，在潮濕和低溫條件下產生的環狀六縮酚酸肽類真菌毒素[2-3]。BEA和ENB能提高陽離子穿過細胞膜能力，由此干擾正常生理水平下細胞的陽離子水平、影響細胞膜的電化學梯度，而產生細胞毒性、免疫毒性、血液等方面毒性[4-5]。國內并無2種新興毒素檢測國家標準，給農產品中BEA和ENB污染狀況調查帶來難度，因此，建立小麥粉中BEA和ENB準確、可操作性強的檢測方法為農產品檢測提供參考。

農產品中真菌毒素常使用混合溶劑提取，采用QuEChERS法、免疫親和柱、多功能凈化柱、固相萃取柱等凈化方法有效降低基質影響，使用液相色譜或液相色譜質譜法進行檢測[6-14]。在綜合文獻基礎上，結合面粉基質干擾情況，采用PEP固相萃取柱凈化，對待凈化液、淋洗液中乙腈比例進行優化，建立UPLC-MS/MS檢測小麥粉中BEA和ENB這2種新興真菌毒素含量，為分析小麥粉中BEA和ENB這2種新興真菌毒素污染現狀提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000-TSQ Quantum Ultra超高壓液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）（美國Thermo公司）；3-18K臺式高速離心機（Sigma中國有限公司）；Milli-Q超純水機（美國密理博公司）；IKA MS3渦旋混均儀（德國IKA公司）；T 460 H型超聲波清洗器（北京博勵行儀器有限公司）。

乙腈、甲酸（色譜純，美國Thermo公司）；乙酸銨（LC-MS級，阿拉丁試劑上海有限公司）、氨水（優級純，上海國藥集團化學試劑有限公司）；PEP固相萃取柱（200 mg 6cc，美國Thermo公司）；MycoSep 226、MycoSep 227、MycoSep 228多功能凈化柱（Romer國際貿易有限公司）；實驗用水為一級水；白僵菌素標準品和恩鐮飽菌素B標準品（青島普瑞邦生物工程有限公司）。

白僵菌素標準品貯備液（1 mg/mL）：取10 mg白僵菌素標準品于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，備用。

白僵菌素標準溶液（100 μg/mL）：準確吸取1.00 mL質量濃度1 mg/mL白僵菌素標準貯備液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，即得質量濃度100 μg/mL白僵菌素標準溶液。

白僵菌素和恩鐮孢菌素B混合標準溶液：分別準確吸取質量濃度均為100 μg/mL白僵菌素和恩鐮飽菌素B標準溶液1.00 mL和0.50 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，備用。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm×1.7 μm，Waters公司）；柱溫35 ℃；進樣體積5 μL；流動相A為0.1%甲酸水溶液；流動相B為甲醇；梯度洗脫程序：0～0.5 min 95% A，0.5～7.5 min 95%的A線性變化為10%，7.5～11 min 10% A，11.1～14 min 95%A；流速0.3 mL/min。

1.2.2 質譜條件

電噴霧（ESI+）離子源；噴霧電壓3 500 V；毛細管溫度300 ℃；蒸發溫度300 ℃；鞘氣壓力273 kPa；輔助氣102 kPa；碰撞氣0.2 Pa；多反應監測（MRM）優化參數見表1。

表1 質譜參數

1.3 樣品提取與凈化

準確稱取5 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入30 mL乙腈-甲酸-水（體積比84︰1︰15）溶液，渦旋混勻，超聲提取30 min，渦旋提取1 min，以10 000 r/min離心5 min，轉移提取液于50 mL刻度離心管中，加入10 mL乙腈-甲酸-水（體積比84︰1︰15）溶液重復提取1次，離心，合并提取液，用乙腈-甲酸-水（體積比84︰1︰15）溶液定容至40 mL，混均，準確吸取10 mL提取液于50 mL刻度離心管中，加入15 mL水稀釋，混均，待凈化。將樣品待凈化液經6 mL甲醇和6 mL水活化后的PEP固相萃取柱凈化，3 mL乙腈-水溶液（體積比40︰60）淋洗并抽干固相萃取柱，用3 mL乙腈均分2次洗脫PEP固相萃取柱，收集洗脫液，混均，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，上機測定。

2 結果與討論

2.1 監測模式的選擇

BEA和ENB 2種新興真菌毒素分子式分別為C45H57N3O9和C33H57N3O9，相對分子質量為783.4和639.4，BEA在N-甲基-氨基酸殘基上具有苯基，ENB在相同位置上具有異丙基，均為環狀六縮酚酸肽類結構，在液質中易于離子化。在甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相、0.3 mL/min流速條件下，以10 μL/min通過針泵將質量濃度均為0.5 μg/mL BEA和ENB這2種新興真菌毒素注入質譜儀器中，采用正離子和負離子模式進行全掃描，BEA和ENB均在ESI+模式下響應信號遠高于ESI-模式下響應信號，所以選擇ESI+模式檢測2種新興真菌毒素。比較ESI+模式下BEA和ENB的[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+、[M+NH4]+的響應情況，結果發現，BEA和ENB這2種真菌毒素[M+H]+響應值＞[M+NH4]+響應值＞[M+Na]+響應值＞[M+K]+響應值。同時，考察甲醇-5 mmol/L的醋酸銨水溶液為流動相條件下，BEA和ENB的響應情況，結果發現BEA的[M+H]+響應值＞[M+NH4]+；ENB的[M+H]+響應值＜[M+NH4]+響應值，但[M+NH4]+與甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相條件下的[M+H]+響應無顯著提高，且以[M+NH4]+為準分子離子進行碰碎，響應高、穩定的碎片離子為m/z640.7，196.0和214.1，而m/z640.7是ENB的[M+H]+離子之間相互串擾，影響定量，所以綜合考慮選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相，BEA和ENB這2種新興真菌毒素均以[M+H]+準分子離子為母離子進行碰碎，進行二級質譜掃描，選擇響應較高、穩定且干擾較小的2個碎片離子構成監測離子對，同時對透鏡電壓、碰撞能量等質譜條件進行優化，優化后的質譜條件見表1。

BEA和ENB這2種新興真菌毒素極性較弱，在反相C18色譜柱上保留較強，采用甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫，BEA和ENB標準的TIC圖譜見圖1。

2.2 樣品提取液的優化

農產品中真菌毒素常采用乙腈、甲醇、乙腈-水、甲醇-水、酸化乙腈、酸化甲醇、酸化乙腈-水和酸化的甲醇-水溶液提取。因為小麥粉中淀粉和蛋白等組分在提取過程中易發生交聯而影響毒素提取效果，所以在提取過程中需加水浸泡展開提高提取效率。BEA和ENB極性弱，仍采用真菌毒素常用的提取溶劑乙腈-水（體積比84︰16）混合溶液提取2種新興毒素，同時比較含1%甲酸酸化的乙腈-水溶液與未酸化的乙腈-水溶液對2種新興毒素的提取回收率，結果表明，小麥粉中BEA采用含1%甲酸酸化的乙腈-水溶液提取回收率（76.25%～99.31%）略高于未酸化乙腈-水溶液的回收率（72.15%～98.93%），而ENB采用含1%甲酸酸化的乙腈-水溶液提取回收率（74.60%～91.17%）略低于未酸化乙腈-水溶液的回收率（76.85%～93.67%）；相同濃度下ENB的響應高于BEA的響應，為了2種新興毒素同時檢測，優先滿足靈敏度低BEA響應，綜合考慮選擇含1%甲酸酸化的乙腈-水溶液提取小麥粉中BEA和ENB這2種新興真菌毒素。

圖1 標準的TIC圖譜

2.3 凈化方法、待凈化液、淋洗液中乙腈比例和洗脫液乙腈用量的優化

小麥粉樣品基質的存在影響BEA和ENB離子化效率，需采用一定凈化方法減小基質的影響。真菌毒素常采用特異性強、回收率高的免疫親和柱凈化，凈化效果較佳，但BEA和ENB這2種新興毒素缺乏商品化市售免疫親和柱。文獻報道，采用快速QuEChERS法凈化，BEA和ENB這2種新興真菌毒素的基質標曲與溶劑標曲斜率比值分別為0.744和0.526，仍存在較強基質抑制效應，凈化效果不佳[11]。分析吸附雜質型多功能凈化柱MycoSep 226、MycoSep 227、MycoSep 228凈化效果，結果表明，3種多功能柱均吸附BEA和ENB這2種新興真菌毒素，吸附率在90%以上，不適用于小麥粉中BEA和ENB的凈化。考察對極性和非極性化合物均有保留且回收率受柱床干涸影響較小的PEP固相萃取柱凈化效果，BEA和ENB這2種新興真菌毒素的低、中、高3個濃度水平的回收率分別在76.25%～99.31%和74.60%～91.17%，滿足小麥粉中痕量BEA和ENB檢測。對比待凈化液中乙腈含量對BEA和ENB這2種新興真菌毒素回收率影響，結果表明，隨著乙腈比例增加，2種新興真菌毒素在PEP柱上保留特性顯著提高，但待凈化液中乙腈比例超過40%后，PEP固相萃取柱對BEA和ENB這2新興真菌毒素保留下降，所以采用PEP固相萃取柱凈化時，應將樣品提取液進行稀釋，乙腈比例控制在30%～40%，保證PEP固相萃取柱對BEA和ENB最佳保留效果。對比淋洗液中不同比例乙腈-水溶液對BEA和ENB這2種新興真菌毒素回收率影響，結果表明淋洗液中乙腈比例越高，淋洗雜質效果越好，基質抑制越弱，但淋洗液中乙腈比例超過40%，BEA和ENB被部分洗脫，回收率下降，淋洗液中乙腈比例50%時，ENB回收率降至80%以下，采用40%乙腈-水溶液，淋洗雜質，減少基質的干擾。考察洗脫液乙腈用量，采用1.5 mL乙腈洗脫固相萃取柱中的BEA和ENB時，2種新興真菌毒素洗脫率在96%左右，目標物洗脫不完全，所以加入1.5 mL乙腈洗脫對目標物進行洗脫，保證2種新興真菌毒素洗脫完全。

2.4 基質效應的考察

食品樣品基質復雜，在UPLC-MS/MS分析中不可避免產生基質效應，表現為基質增強或基質抑制。采用基質標準溶液曲線斜率和溶劑標準溶液曲線斜率之比（K）評價基質效應，K大于1時為基質增強效應，K小于1時為基質減弱效應，K等于1時無基質效應，結果表明，BEA和ENB這2種新興真菌毒素使用PEP固相萃取柱凈化后的小麥粉空白基質溶液配制標準曲線和溶劑標準曲線斜率比分別為0.945和0.922，即基質抑制效應在可接受范圍內，為提高小麥粉中BEA和ENB定量結果準確性，仍采用基質匹配的標準曲線定量。

2.5 標準曲線與定量限

將BEA和ENB這2種新興真菌毒素混合標準溶液逐級稀釋，用小麥粉樣品空白凈化基質溶液配制成BEA質量濃度為0，1.25，2.50，5.00，10.0，20.0，30.0，40.0和50.0 ng/mL以及ENB質量濃度為0，0.625，1.25，2.50，5.00，10.0，15.0，20.0和25.0 ng/mL基質匹配標準曲線，在優化的儀器工作條件下進樣分析，以質量濃度（x）為橫坐標、響應值峰面積（Y）為縱坐標繪制基質匹配的標準曲線，BEA和ENB基質匹配標準曲線回歸方程分別為YBEA=2.71×105x+1.67×104（r=0.999 5）、YENB=6.17×105x+7.25×104（r=0.999 7），2種新興真菌毒素在相應的濃度范圍內線性關系良好，以S/N=10計算方法定量限，結果分別為3和1.5 μg/kg。

2.6 方法精密度和回收率試驗

在空白樣品中加入定量限附近、標準曲線中間點和高濃度點驗證方法的準確性，選擇在空白小麥粉樣品中加入BEA質量濃度為4.8，48和96 μg/kg，結果ENB質量濃度為2.4，24和48 μg/kg低、中、高3個濃度水平的2種新興真菌毒素標準品，渦旋混均，放置30 min，使其樣品基質與標準品充分接觸，按照1.3的樣品前處理進行處理及測定，每個添加濃度水平測定6份平行樣，方法加標回收率及重現性相對標準偏差結果見表2。

由表2可知，BEA和ENB測定方法平均回收率分別為76.25%～99.31%和74.60%～91.17%，小麥粉中方法的重現性相對標準偏差低于10%。與韓小敏等[15]文獻報道的小麥粉中BEA和ENB回收率分別為100.5%～126.0%和114.6%～123.1%相比偏低，但考察BEA和ENB加標回收率低端濃度水平分別為50和20 μg/kg，是定量限192倍（BEA定量限0.26 μg/kg）和400倍（ENB定量限0.05 μg/kg），不能準確反映出定量限附近方法的準確度，所以試驗考察定量限附近方法的加標回收率，BEA和ENB低、中、高3個濃度水平的加標回收率均大于70%，滿足痕量真菌毒素的分析要求。

表2 方法加標回收率及精密度結果（n=6）

2.7 實際樣品測定

應用試驗方法對超市隨機購買的10批次小麥粉中BEA和ENB進行檢測，其中2批次樣品檢出白BEA，含量分別為3.69和5.73 μg/kg；1份檢出ENB，含量為4.42 μg/kg。

3 結論

建立基于PEP固相萃取柱凈化、基質匹配標準曲線定量、超高效液相色譜-串聯質譜檢測小麥粉中BEA和ENB這2種新興真菌毒素測定方法。BEA和ENB這2種新興毒素分別在0～50 ng/mL和0～25 ng/mL質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.999。在空白樣品中添加低、中、高3個濃度水平的BEA和ENB標準品，平均回收率均大于70%，方法重現性相對標準偏差小于10%，采用PEP固相萃取柱凈化，有效降低小麥粉中樣品基質的影響，適用于小麥粉中痕量BEA和ENB這2種新興真菌毒素檢測，為分析小麥粉中BEA和ENB污染水平提供參考依據。