高效液相色譜法測定餅干中的9種合成著色劑

劉秀娟，曹秀，余明霞，董小海，鐘紅艦

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所（鄭州 450002）

合成著色劑具有價格低廉、色澤鮮艷、容易著色、性質(zhì)穩(wěn)定等特點，因而在食品加工工藝中有著廣泛的應(yīng)用[1-2]。但是，合成著色過量攝入會引起慢性中毒，可導(dǎo)致致畸、致癌等風(fēng)險增加。GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定了人工合成著色劑作為食品添加劑的最大使用限量[3]。

目前，合成著色劑的檢測方法主要有高效液相色譜法[4-10]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-13]，最常用的是高效液相色譜法。餅干常在加工過程中添加食用著色劑以改善其感官色澤，合成著色劑與蛋白質(zhì)強(qiáng)烈結(jié)合，在提取過程中，難以分離，且有大量色素吸附于沉淀蛋白中，從而導(dǎo)致檢測回收率降低、穩(wěn)定性變差等問題。GB/T 5009.35—2016《食品中合成著色劑的測定》中液相色譜法未涵蓋餅干食品。此次試驗對餅干樣品中合成著色劑的前處理條件進(jìn)行優(yōu)化研究，建立高效液相色譜法測定餅干中9種合成著色劑的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇，色譜純，德國Merck公司；乙酸銨，色譜純，美國Fisher公司；乙醇、氨水、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、甲酸均為色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HLB柱（150 mg/6 mL），美國Waters公司；試驗用水均為超純水。

檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、赤蘚紅、亮藍(lán)，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；新紅，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；靛藍(lán)，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT，配有二極管陣列檢測器，島津公司；GL-21B型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠離心機(jī)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；QGC-36型自動氮吹濃縮儀，上海泉島公司；固相萃取裝置，美國Agilent公司；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)，美國密理博公司；分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

樣品提取：取2 g左右（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加入25 mL無水乙醇-氨水-水（7：2：1，V/V），渦旋1 min，超聲提取45 min，以8 000 r/min 4 ℃離心5 min，取10 mL上清液于40 ℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用10 mL 4%甲酸水溶解用HLB柱凈化。

樣品凈化：HLB柱使用前分別用5 mL甲醇、5 mL水活化。將待凈化液過柱，用5 mL 1%甲酸水淋洗，5 mL 2%氨水-甲醇洗脫，將洗脫液于40 ℃氮吹至近干，用2 mL水溶解過膜，上機(jī)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別吸取1.00 mL胭脂紅、莧菜紅、日落黃、檸檬黃、赤蘚紅、新紅、靛藍(lán)、亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液以及0.50mL誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水定容于10 mL容量瓶中，配制成50 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取50.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，逐級稀釋成0.20，0.50，0.80，1.00，2.00和5.00 μg/mL，按照色譜條件進(jìn)樣，以各色素峰面積對濃度做線性回歸分析。

1.3.3 色譜條件

Syncronis C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；二極管陣列檢測器；流動相：甲醇和0.02 mol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫，流動相梯度洗脫程序如表1所示。

2 結(jié)果和討論

2.1 提取溶劑的選擇

由于著色劑易溶于水、微溶于乙醇，樣品用水超聲提取，著色劑和蛋白質(zhì)結(jié)合較難從樣品中提取出來，用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白時會吸附合成著色劑，造成回收率較低，回收率在30%以下。用無水乙醇-氨水-水提取時，合成著色劑不會隨蛋白質(zhì)去除而損失，回收率相對較高，故采用無水乙醇-氨水-水作為樣品提取劑。

2.2 線性范圍及檢出限

將混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，經(jīng)超高效液相色譜測定，以峰面積為橫坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度為縱坐標(biāo)，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限（見表2）。結(jié)果顯示，在0.20～5.00 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，9種合成色素的峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，可進(jìn)行準(zhǔn)確定量。以S/N=3計算9種合成色素的檢出限。

2.3 回收率及精密度試驗

取壓縮餅干樣品，按低、中和高3種不同濃度水平添加含9種合成色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品按1.3.1小節(jié)處理后進(jìn)行測定，分別計算9種合成色素的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表3可知，該方法在不同加標(biāo)水平下的回收率為73.1%～94.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（δRSD）為1.0%～4.6%，具有較好的準(zhǔn)確度。

表2 9種合成色素的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

表3 9種合成色素的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論

方法選擇固相萃取-高效液相色譜法對餅干中9種人工合成著色劑進(jìn)行檢測，采用梯度洗脫程序分離，靈敏度高，精密度、準(zhǔn)確度良好，能滿足餅干中9種人工合成著色劑檢測的需要。結(jié)果表明，該方法具有前處理簡單、凈化效果好、回收率穩(wěn)定、一次處理能同時測定多種人工合成著色劑等優(yōu)點。