液相色譜質譜法測定生牛乳中左旋咪唑

倪紅妹，趙偉

1. 國家輕工業食品質量檢測上海站（上海 200090）；2. 上海市質量監督檢驗技術研究院（上海 200233）

左旋咪唑為四咪唑的左旋體，是一種廣譜驅蟲藥，隨著左旋咪唑使用范圍的不斷擴大，養殖戶為追求經濟利益，違規超量使用，造成藥物在動物源性可食用組織中殘留。澳大利亞胃腸道線蟲是限制乳品企業發展的疾病之一，特別影響泌乳早期產奶和小母牛的增重。農民依賴驅蟲劑來控制寄生蟲病的發生，長期、連續地使用驅蟲藥物，導致藥物在動物體內的殘留。盡管動物源食品中獸藥殘留的水平比較低，但長期食用這類動物源食品，藥物殘留會隨食物鏈間接地在人體內堆積，最終產生病變，從而造成實質性和難以逆轉的危害[1]。有統計報道顯示，在2007年前左旋咪唑嚴重不良反應有600多例，文獻中左旋咪唑引起的黃疸性肝炎病1例，大劑量左旋咪唑致急性腎功能衰竭2例，左旋咪唑所致腦病10例等[2-4]。

目前，國內外針對檢測左旋咪唑的方法主要有電位滴定法、拉曼分析法、氣相色譜-串聯質譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯質譜法等。我國已出臺牛奶和奶粉中左旋咪唑殘留量液相色譜-串聯質譜的測定方法GB/T 22994—2008，但其樣品前處理較繁瑣。

試驗擬將改進的QuEChERS方法[5]應用于樣品前處理，采用LC-MS/MS測定生乳中左旋咪唑殘留量。方法簡便、快速、準確、靈敏，且能滿足相關法規對生乳中左旋咪唑殘留限量要求。

1 試驗材料和試劑

1.1 試驗材料

生牛乳（從上海崇明城橋鎮馬橋村縣購得）。

1.2 試驗試劑

乙腈、甲酸、甲醇、乙酸銨（色譜純，默克）；乙酸（分析純，高信）；C18固相萃取填料（50 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司）；左旋咪唑標準物質（純度≥98%，德國Witega GmbH公司）；提取液（1%乙酸乙腈）；樣品定容液（乙腈+0.1%甲酸水，1+9）。

1.3 試驗儀器和設備

Waters Xevo TQ-S液相色譜-串聯質譜儀（沃特世科技）；分析天平（德國梅特勒）；低溫高速離心機（日立）；臺式高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；超聲波提取儀（UNISONICS公司）；臺式混勻器（美國賽默飛科技）；氮吹儀（銘奧國際有限公司）。

2 試驗方法

2.1 標準溶液的配制

2.1.1 標準儲備液

精確稱取5 mg左旋咪唑標準品，用1%乙酸乙腈溶解后定容至50 mL，得到100 μg/mL的標準儲備液，于-18 ℃保存。

2.1.2 標準中間液

吸取0.25 mL標準儲備液，用1%乙酸乙腈定容至25 mL，得到1.00 μg/mL的標準中間液，于4 ℃保存。

2.1.3 標準工作溶液

吸取2.50 mL標準中間液，用樣品定容液定容至25 mL，得到100 ng/mL標準工作液，現配現用。

2.2 樣品提取

準確稱取2.5 g（精確至0.01 g生乳樣品），加入10 mL提取液混勻，再加入Cleanert MAS-Q粉，超聲提取20 min后以10 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

2.3 樣品凈化

取全部上清液，加入250 mg QuEChERS C18粉，混勻30 s后以10 000 r/min離心。取5.00 mL上清液于30 ℃下氮吹濃縮至近干，用樣品定容液定容至1.00 mL，混勻后過0.22 μm濾膜，待測。

2.4 基質標準溶液的制備

準確稱取6份2.5 g的陰性試樣（精確至0.01 g），加入10 mL提取液混勻，按照最終定容質量濃度0.5，1，2，5，10和20 ng/mL，加入標準工作溶液，余下操作同2.2和2.3小節。

2.5 液相串聯質譜儀的測定

2.5.1 色譜條件

色譜柱，T-3色譜柱100 mm×2.1 mm×1.7 μm，美國Waters公司；進樣量1.0 μL；流動相A為5 mol/L乙酸銨含0.1%甲酸水，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序見表1；流速0.4 mL/min；柱溫30 ℃。

表1 流動相、流速及梯度洗脫條件

2.5.2 質譜條件

離子源模式，ESI正離子MRM模式；毛細管電壓，2 000 V；錐空電壓，40 V；脫溶劑溫度，500 ℃；左旋咪唑定量離子對，205.1＞178；定性離子對，205.1＞91。

3 試驗結果與分析

3.1 液相條件和色譜柱

3.1.1 液相流動相的選擇

選取100 ng/mL的標準工作液，用0.1%甲酸水和甲醇、0.1%甲酸水和甲醇、5 mol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）和乙腈、5 mol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）和乙腈四種不同流動相體系進行試驗，選擇最合適的流動相和梯度條件。試驗過程中發現左旋咪唑在0.1%甲酸水和甲醇、0.1%甲酸水和乙腈、5 mol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）和甲醇的體系峰均有明顯的拖尾；5 mol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）和乙腈體系下沒有出現拖尾，峰型也對稱，故選擇5 mol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）和乙腈為流動相，試驗結果見圖1～圖4。

圖1 0.1%甲酸水和甲醇流動相體系下左旋咪唑標準品總離子流圖（10 ng/mL）

圖2 0.1%甲酸水和乙腈流動相體系下左旋咪唑標準品總離子流（10 ng/mL）

圖3 5 mol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）和甲醇流動相體系下左旋咪唑總離子流圖（10 ng/mL）

圖4 5 mol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）和乙腈流動相體系下阿司匹林總離子流圖（10 ng/mL）

3.1.2 色譜柱的選擇左旋咪唑含有咪唑駢噻唑這一特定結構，極易溶于水，試驗嘗試了Waters BEH C18柱和Waters T-3柱。Waters BEH C18柱和Waters T-3柱對左旋咪唑均有很好的保留，且峰型對稱尖銳，T-3柱比BEH C18柱保留能力更強，可以使目標物質和雜質分離效果更佳。故選擇T-3柱作為試驗用柱，試驗結果見圖5和圖6。

圖5 BEH C18柱分離的左旋咪唑標準品MRM流圖（10 ng/mL）

圖6 T-3柱分離的左旋咪唑標準品MRM流圖（10 ng/mL）

3.2 基質效應和QuEChERS吸附劑的選擇

基質效應是影響液質定量分析準確性的重要因素，是指基質成分和目標化合物在電噴霧離子源進行離子化時相互競爭的結果，包括基質增強效應和基質抑制效應。按方法將陰性生乳處理，得到空白基質溶液，用此溶液稀釋標準工作液配制成0.5和20 ng/mL基質空白標準溶液，用樣品定容液稀釋標準工作液配制成0.5和20 ng/mL溶劑空白標準溶液。將2種標準溶液經液相串聯質譜儀測定，結果表明基質空白標準溶液均比溶劑空白標準溶液的響應值低20%，說明在這個方法條件下，基質抑制效應很明顯，這會影響最后結果定量的準確度。故試驗選擇陰性基質空白溶液來配制標準工作曲線。

按方法將20 ng/mL的標準溶液分別用Carb、PSA、C18固相萃取填料和Waters Prime HLB固相萃取柱凈化，經液相串聯質譜儀測定，結果表明左旋咪唑在Waters Prime HLB固相萃取凈化過程中被完成吸附，回收率為0；左旋咪唑在PSA、Carb填料凈化過程中被部分吸附，回收率為45%和65%；C18填料凈化過程中對左旋咪唑沒有吸附作用，回收率為98%。故試驗選擇C18填料作為方法凈化用吸附劑。

3.3 標準曲線和檢出限

試驗采用陰性基質空白溶液配制成工作曲線（0.5，1，2，5，10和20 ng/mL），以目標組分的峰面積Y對相應的質量濃度X（ng/mL）由儀器自動生成標準曲線（圖7）。左旋咪唑的曲線方程為Y=16 441.2X-249.072，相關線性系數R=0.999 9。檢出限和定量限按信噪比的3倍和10倍計算得到，其檢出限為0.4μg/kg，定量限為1.2 μg/kg。結果表明，左旋咪唑在0.5～20 ng/mL濃度范圍內線性成良好關系，方法檢出限和定量限均能滿足日常檢測工作需要。

圖7 左旋咪唑基質空白標準曲線

3.4 回收率和精密度

在陰性樣品中添加0.4，1.2和4 μg/kg 3個濃度的左旋咪唑，按方法處理后測定并計算回收率和精密性，結果見表2。其回收率在93.1%～107%之間，測定結果（n=6）的相對標準偏差在3.10%～6.15%之間。由此可知該方法具有較高的準確性。

表2 生乳左旋咪唑加標收率及相對標準偏差（n=6）

3.5 定性結果

以基質空白標準品和試驗樣品中保留時間（偏差在±2.5%之內）和監測離子的相對豐度比（監測離子相對豐度的大允許偏差見表3）作為定性依據，由表4可知試驗數據均在偏差要求范圍內，故方法能滿足定性的要求。

表3 監測離子相對豐度的大允許偏差

表4 生乳中左旋咪唑定性結果（豐度比）

表5 生乳中左旋咪唑定性結果（保留時間）

4 結論

采用液相色譜質譜法測定生牛乳中左旋咪唑的含量，方法在0.5～20 ng/mL質量濃度范圍內具有良好的線性相關性，方法對左旋咪唑的檢出限為0.4 μg/kg，定量限為1.2 μg/kg，加標回收率在93.1%～107%之間，相對標準偏差在3.10%～6.15%之間，同時考慮了基質效應對試驗結果的影響。該方法簡便、快速、回收率高和重現性好，可滿足對生牛乳的生產過程控制及室驗室樣品定性定量檢測的要求。