丹參多酚酸與三七總皂苷合用保護OGD/R損傷膠質細胞線粒體、促進神經因子表達作用研究*

曹玉爽，徐 耀，楊 娟，袁 慶，姚榮妹，柴麗娟，胡利民

（天津中醫藥大學組分中藥國家重點實驗室，天津 301600）

中風是全球第二大死亡原因，多為缺血性中風[1]。生理狀態下的大腦活動高度依賴能量，線粒體作為能量供應的介導者，將能量需求與ATP供應相匹配，調節Ca2+信號，協調局部代謝[2]。但缺血性中風發生過程中，腦內環境穩態遭到破壞，線粒體代謝障礙、信號轉導改變等的相應發生最終導致細胞的凋亡和壞死，造成人體出現某些難以恢復的機能障礙[3-4]。在此過程中，星形膠質細胞激活可上調神經生長因子的分泌以及多種蛋白質的合成，增加谷氨酸攝取能力，有助于腦缺血后受損神經元的修復和再生；但腦缺血再灌注損傷也會導致星形膠質細胞功能受損，繼而加重神經元的死亡[5-8]。因此保護腦缺血/再灌注后星形膠質細胞結構與功能的完整性是研究的熱點之一。

注射用丹參多酚酸和血栓通注射液在臨床上常用于治療缺血性中風，研究證明，前者對缺血性腦中風恢復期有很好的治療效果[9]，后者可改善腦梗死患者的炎癥損傷和神經受損[10]，療效顯著，但研究對其作用的機制了解較少[11-12]。本研究以中風后星形膠質氧化為關注點，探討上述二藥的組分丹參多酚酸和三七總皂苷合用對膠質細胞線粒體的保護作用及機制，并進一步研究膠質細胞受到保護后神經營養因子的表達情況，以更好地闡釋丹參多酚酸和三七總皂苷在腦缺血再灌注損傷中的保護機制。

1 材料

1.1 材料與試劑 注射用丹參多酚酸（天津天士力之驕藥業有限公司），注射用血栓通（凍干）（廣西梧州制藥（集團）股份有限公司），DMEM/F12、特級胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），Hanks、D-Hanks、0.25%胰蛋白酶、L-谷氨酰胺（L-glutamine，L-Glu）、青霉素-鏈霉素（Penicillin-Streptomycin Solution，PS）均購自美國Gibco公司，多聚甲醛、牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）、山羊血清、EBSS、TBST、電轉液、bicinchoninic acid（BCA）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），CCK-8試劑盒（日本同任化學研究所），Trizol試劑、Tetramethylrhodamine（TMRM）、CM-H2DCFDA（美國 Invitrogen公司），Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit（武漢塞維爾生物科技有限公司），SYBR GREEN PCR master Mix（美國Applied Biosystem公司），鞘液（美國BD公司），RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司），Anti-GFAP（英國 Abcam 公司），Anti-HIF-1α（美國 Abcam公司），Anti-β-actin、Anti-Akt/p-Akt、Anti-mTOR/pmTOR、Anti-PI3K/p-PI3K、Anti-p44/42/p-p44/42（美國CST公司），羊抗鼠IgG抗體-HRP、羊抗兔IgG抗體-HRP（北京中杉金生物科技有限公司），Fluo-3，AM（凱基生物）。

1.2 主要儀器 CO2培養箱（美國Thermo公司），離心機（德國Eppendorf公司），倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司），倒置相差顯微鏡（美國Zeiss公司），缺氧小室（加拿大STEMCELL Technologies），多功能酶標儀（瑞士TECAN公司），實時熒光定量PCR儀、C1000PCR擴增儀（美國BIO-RAD），超微量核酸分析儀（日本馬康Malcom），Western Blot電泳槽、轉膜儀（上海天能），Western Blot凝膠成像系統（美國GE公司），流式細胞儀FACS Calibur（美國BD），恒溫搖床（中國巴玖公司）。

2 方法

2.1 大鼠原代星形膠質細胞的培養與鑒定

2.1.1 大鼠原代星形膠質細胞的培養 培養方法參照相關文獻[13-15]，將大鼠酒精浸泡處死后，斷頭，將腦組織取出放入預冷的PBS中，取出腦膜及大血管，分離兩側皮質，用滅菌液（含5%PS的PBS）清洗兩次并剪碎至呈乳糜狀，加入0.25%EDTA消化10 min再以全培（1%PS+1%L-Glu+15%FBS+83%DMEM/F12）終止消化。離心后重懸，過200目細胞篩，將所得濾液再次離心、全培養基重懸后，接種于培養瓶中，CO2恒溫培養箱中培養1 h后，收集上層培養液。轉移至新的培養瓶繼續培養，每3 d換液1次。8～9 d后置于氣浴搖床中260 r/min震搖20 h棄去培養液即可傳代備用。本實驗選用二代及以上細胞。

2.1.2 大鼠原代星形膠質細胞的鑒定 倒置顯微鏡下細胞生長狀態，待生長至約70%～80%時，用預冷PBS清洗細胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗去多聚甲醛后加入封閉液（5%山羊血清+0.3% Triton X-100+PBS）于室溫封閉60 min，隨后加入anti-GFAP抗體（1∶250稀釋），4℃過夜孵育。次日吸棄一抗，PBS洗滌2次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，室溫避光孵育30 min，再以PBS清洗后加入DAPI核染液室溫放置2 min，即可置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.2 OGD/R模型的建立與藥物有效濃度的篩選

2.2.1 OGD/R模型的建立 將細胞接均勻種于96孔板中，接種密度1×105個/cm2，待生長至80%將其分為Con組和OGD/R組并進行以下處理。

Con組：將細胞培養液更換為新鮮的DMEM/F12全培基，置于CO2培養箱中培養相應時間后更換為含7.5%血清全培基。

OGD/R組：將培養液更換為EBSS平衡鹽溶液，放入缺氧小室并通入95% N2、5% CO2氣體5 min，而后將缺氧小室置于37℃恒溫箱中培養。在氧糖剝奪2、3、4 h后，打開缺氧小室，將細胞上層EBSS更換含7.5%血清全培基做復氧處理 2、3、4、24、48、72 h。棄去培養液，在96孔板中加入CCK-8工作液37℃孵育60 min，450 nm波長檢測吸光度。

2.2.2 藥物對正常培養和OGD/R處理膠質細胞活力的影響 細胞接種情況同上，待生長至80%，將培養液更換為含不同濃度丹參多酚酸組分（1.625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg·mL-1）或三七總皂苷 組 分（3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 μg·mL-1）的含藥培養基正常培養 24h，CCK-8法檢測細胞活力，篩選藥物的無毒性劑量。

藥物對OGD/R處理膠質細胞活力的影響：根據“2.2.1”所確定的OGD/R模型條件，給予不同濃度含藥培養基干預24 h后CCK-8法檢測細胞活力，篩選藥物的有效劑量。

2.3 藥物對OGD/R損傷星形膠質細胞的保護作用與機制

2.3.1 流式細胞術檢測星形膠質細胞線粒體膜電位將細胞均勻接種于6孔板中，種植密度為1×105個/cm2，待細胞生長至80%時，根據“2.2.1”所確定的模型條件，將細胞為Con組、OGD/R組和給藥組。OGD/R組和給藥組做氧糖剝奪處理，復氧復糖時給藥組另加入“2.2.2”所確定的劑量的藥物。復氧復糖處理后加入TMRM工作液1 mL/孔，37℃避光孵育，30 min后對細胞進行消化處理，離心后以PBS重懸細胞，流式分析。

2.3.2 流式檢測星形膠質細胞包內鈣離子濃度 細胞處理同“2.3.1”，復氧復糖處理后加入含Fluo-3，AM的培養液避光孵育30 min，再加入HBSS避光孵育20 min，胰酶消化制成單細胞懸液，離心后以HBSS重懸細胞，流式檢測。

2.3.3 流式檢測星形膠質細胞ROS釋放量 細胞處理同“2.3.1”，復氧復糖處理后加入CM-H2DCFDA工作液，避光孵育30 min，清洗細胞后可直接用于熒光拍照（488/525）或同制成單細胞懸液進行流式分析。

2.3.4 RT-PCR法檢測HIF-1α mRNA的表達 細胞處理同“2.3.1”，復氧復糖后Trizol試劑提取總RNA，超微量核酸分析儀560 nm/580nm定量分析。按照 Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書和SYBR GREEN PCR Master Mix試劑盒說明書進行逆轉錄和擴增（HIF-1α引物序列為F：CCGATGGAAGCACTAGACA；R：CAAAGCGACAGATAACACG），檢測HIF-1α的mRNA表達情況。

2.3.5 Western Blot法檢測 HIF-1α、PI3k信號通路蛋白的表達 細胞處理同“2.3.1”，復氧復糖處理后加入蛋白酶裂解液提取總蛋白，利用BCA試劑盒定量并加熱100℃，10 min使其變性。12%SDS-PAGE膠進行電泳（170 V，45 min）、而后250 mA將蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入1∶1 000稀釋的一抗（HIF-1α、PI3k、Akt、mTOR 抗體）4℃孵育過夜，TBST，5 min每次清洗后3次后，加入二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，ECL顯影，GE凝膠成像系統成像。

2.4 藥物對OGD/R損傷后星形膠質細胞神經營養因子表達的影響 RT-PCR法檢測BDNF、NGF、IGF-1α mRNA的表達，實驗方法同前。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 統計方法 SPSS17.0統計軟件分析數據，表示結果，one-way ANOVA（單因素方差分析）分析數據，P＜0.05為具有統計學差異。

3 結果

3.1 大鼠原代星形膠質細胞的培養與鑒定 如圖1所示，星形膠質細胞在培養瓶中培養7 d后，星形膠質細胞形狀多為不規則多角形，可見粗短枝狀胞突，胞體大而扁平，符合神經膠質細胞生長特性。神經膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）熒光染色陽性，表明研究培養星形膠質細胞成功，且純度較高，可用于后續實驗。

圖1 原代星形膠質細胞的生長情況與鑒定

3.2 細胞OGD/R模型建立與藥物有效濃度篩選

3.2.1 氧糖剝奪不同時間對星形膠質細胞活力的影響如圖2A-C所示，與Con組相比，OGD 2 h/R 48、72 h，OGD 3 h/R 2、3、4、24、48、72 h，OGD 4 h/R 2、3、4、24、48 h細胞活力均顯著下降（P＜0.05）。故研究采用OGD 4 h/R 24 h作為星形膠質細胞缺氧復氧處理模型。

3.2.2 藥物對正常星形膠質細胞活力的影響 如圖2D-E所示，與Con組相比，丹參多酚酸組分在1.625～200 μg·mL-1范圍內對細胞活力沒有顯著性差異（P＞0.05），三七總皂苷組分在 3.125～800 μg·mL-1對細胞活力均沒有顯著性差異（P＞0.05），提示本實驗所選藥物濃度對細胞沒有毒性。

3.2.3 藥物對OGD/R損傷星形膠質細胞活力的保護作用 如圖 2F-H所示，與Con組相比，OGD/R組星形膠質細胞的活力顯著降低（P＜0.05）；與OGD/R組比較，25 μg·mL-1丹參多酚酸組分顯著提高星形膠質細胞活力（P＜0.05）；三七總皂苷組分所選取濃度均能顯著提高受損細胞活力（P＜0.05）。故選取丹參多酚酸組分 25 μg·mL-1和三七總皂苷組分 6.25 μg·mL-1進行后續實驗。

圖2 藥物及不同OGD/R時間對星形膠質細胞活力的影響（±s，n=18）

3.3 藥物對OGD/R損傷星形膠質細胞的線粒體的保護作用

3.3.1 藥物對OGD/R損傷星形膠質細胞線粒體膜電位、胞內鈣離子濃度及ROS釋放量的影響 結果如圖3所示，A-C：與Con組相比，OGD/R組星形膠質細胞熒光強度降低，線粒體膜電位降低；與OGD/R組相比，丹參多酚酸組分（25 μg·mL-1）、三七總皂苷組分（6.25 μg·mL-1）、丹參多酚酸（25 μg·mL-1）與三七總皂苷（6.25 μg·mL-1）合用均可升高 OGD/R 損傷后星形膠質細胞的線粒體膜電位。流式細胞儀檢測細胞內Ca2+濃度，與Con組相比，OGD/R組星形膠質細胞內熒光強度增強，Ca2+濃度升高（P＜0.05）；與OGD/R 組相比，丹參多酚酸組分（25 μg·mL-1）可顯著降低胞內Ca2+濃度（P＜0.05）；三七總皂苷組分（6.25 μg·mL-1）、丹參多酚酸（25 μg·mL-1）與三七總皂苷（6.25 μg·mL-1）合用均可對 Ca2+濃度無影響（P＞0.05）。F-H：與Con組相比，OGD/R組細胞ROS釋放量顯著增加（P＜0.05）；與OGD/R組相比，丹參多酚酸組分（25 μg·mL-1）、三七總皂苷組分（6.25 μg·mL-1）、丹參多酚酸（25 μg·mL-1） 與三七總皂苷（6.25 μg·mL-1）合用均可顯著降低OGD/R損星形膠質細胞ROS的釋放量（P＜0.05）。可見，丹參多酚酸、三七總皂苷及其合用可顯著降低OGD/R損傷后星形膠質細胞的ROS釋放，提高線粒體膜電位。

圖3 藥物對OGD/R損傷星形膠質細胞線粒體的影響

3.3.2 藥物對OGD/R損傷星形膠質細胞HIF-1α、PI3K/Akt/mTOR通路的作用 RT-PCR與Western Blot結果如圖4所示，A-B：與Con組相比較，OGD/R組細胞HIF1α mRNA表達顯著升高（P＜0.05）；與OGD/R 組相比，丹參多酚酸組分（25 μg·mL-1）、三七總皂苷組分（6.25 μg·mL-1）、丹參多酚酸（25 μg·mL-1）與三七總皂苷（6.25 μg·mL-1）合用均可顯著降低 OGD/R損傷星形膠質細胞HIF-1α蛋白的表達（P＜0.05）。C-E：與Con組比較，OGD/R組能顯著降低星形膠質細胞 PI3K/Akt蛋白磷酸化水平（P＜0.05）；與OGD/R組比較，丹參多酚酸組分（25 μg·mL-1）、三七總皂苷組分（6.25 μg·mL-1）、丹參多酚酸（25 μg·mL-1）與三七總皂苷（6.25 μg·mL-1）合用均能升高 PI3K 蛋白磷酸化水平（P＜0.05）；三七總皂苷組分（6.25 μg·mL-1）能顯著升高Akt蛋白磷酸化水平（P＜0.05），丹參多酚酸組分（25 μg·mL-1）、丹參多酚酸（25 μg·mL-1）與三七總皂苷（6.25 μg·mL-1）合用對 Akt蛋白磷酸化水平有升高作用，但不具有顯著性差異（P＞0.05）；與Con比較，OGD/R組mTOR磷酸化水平略有升高但不具有顯著性差異（P＞0.05）；與OGD/R組相比較，丹參多酚酸組分組（25 μg·mL-1）能顯著升高 mTOR 磷酸化水平（P＜0.05）；而三七總皂苷組分（6.25 μg·mL-1）、丹參多酚酸（25μg·mL-1）與三七總皂苷（6.25 μg·mL-1）合用對mTOR蛋白磷酸化水平的改變無顯著性差異（P＞0.05）。可見，丹參多酚酸和三七總皂苷對損傷星形膠質細胞的作用途徑可能與PI3K/Akt/mTOR信號通路相關。

圖4 藥物對OGD/R損傷星形膠質細胞HIF-1α、PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響

3.4 藥物對OGD/R損傷后星形膠質細胞神經營養因子表達的影響 RT-PCR結果如圖5所示，與Con組相比較，OGD/R組細胞BDNF、IGF-1α mRNA表達顯著降低（P＜0.05），IGF-1α mRNA 無顯著差異（P＞0.05）；與 OGD/R 組相比，丹參多酚酸組分（25 μg·mL-1）單用和與三七總皂苷組分（6.25 μg·mL-1）合用均可顯著提高OGD/R損傷后星形膠質細胞BDNF、NGF、IGF-1α mRNA 的表達（P＜0.05）；三七總皂苷組分（6.25 μg·mL-1）可顯著升高 OGD/R 損傷星形膠質細胞 BDNF mRNA 表達（P＜0.05），對 NGF、IGF-1α mRNA有上調趨勢，但無統計學意義（P＞0.05）。可見，丹參多酚酸、三七總皂苷及其合用可增加膠質細胞神經營養因子的表達。

圖5 藥物對OGD/R損傷后膠質細胞神經營養表達的影響

4 討論

中風是由臟腑失調，氣血逆亂，直沖犯腦引起的腦脈痹阻或血溢腦脈之外，臨床以半身不遂、口舌歪斜、言語謇澀或不語等為常見癥狀。因其高發病率、高致殘率、高死亡率、高復發率和多并發癥的“四高一多”的特點，一直為研究熱點。近年來，中醫藥在中風方面研究較多，凸顯了中醫藥獨特、良好的發展前景。

注射用丹參多酚酸由丹參多酚酸組成，具有活血通絡的功效，常用于中風病恢復期瘀血阻絡證。研究發現，注射用丹參多酚酸可有效改善患者的早期臨床癥狀、促進遠期神經功能恢復，安全性高，值得臨床推廣使用[16-17]。血栓通注射液的主要成分是三七總皂苷，具有活血化瘀、擴張血管、改善血液循環的功效，常用于腦血管病后遺癥。研究表明，血栓通注射液的輔助治療可以促進患者神經功能恢復，改善血液流變學指標，提高患者的生活自理能力[18-19]。

盡管療效顯著，注射用丹參多酚酸和血栓通注射液的作用機制尚不十分明確。膠質細胞作為腦中最豐富的細胞[20]，在維持大腦的正常生理狀態中起重要作用[21-22]。然而，在缺血性損傷時，星形膠質細胞分泌炎性因子，例如血管內皮生長因子（VEGF），基質金屬蛋白酶（MMPs），直接或間接地加劇腦損傷，破壞血腦屏障。此外還可通過釋放營養因子維持BBB穩態，支持和保護神經元，還可通過調節離子平衡來維持內環境穩態[23]，為葡萄糖和其它代謝物在血液和神經元之間的傳播提供途徑[24-25]。因此，本實驗立足于藥物對星形膠質細胞的保護作用，研究其發揮療效的作用機制。

4.1 藥物對損傷后膠質細胞線粒體的保護 線粒體是活性氧ROS的產生場所和靶點，也是ATP水平和鈣穩態的調節劑，是細胞代謝的重要場所。線粒體膜電位（MMP）維持線粒體進行磷酸化、決定三磷酸腺苷產生，膜電位的穩定利于維持細胞的生理功能。研究近年來發現，伴隨MMP的下降，細胞在不同因子作用下發生凋亡，該下降早于DNA片段化，在細胞凋亡早期病理變化以前就開始。中風發生時，氧和葡萄糖的缺乏會造成能量衰竭、線粒體功能障礙、ROS增加。研究利用流式細胞儀觀察OGD/R后膠質細胞的線粒體膜電位、細胞內鈣離子以及ROS的變化。結果顯示，丹參多酚酸、三七總皂苷、丹參多酚酸與三七總皂苷合用可通過調節星形膠質細胞ROS釋放量、胞內鈣離子濃度、線粒體膜電位改善缺血再灌注造成的損傷。

PI3K/Akt途徑是細胞相應胞外生存和生長的信號的轉導途徑。催化亞基p110和調節亞基p85構成二聚體磷脂酰肌醇激酶（PI3K），當PI3K與EGF生長因子等受體結合后，可活化Akt，Akt激活后促進或抑制下游蛋白如Caspase9、Bad等凋亡蛋白的表達，從而調節細胞的增殖、分化、凋亡和遷移。PI3K/Akt下游靶點為雷帕霉素靶蛋白（mTOR），mTOR的下游轉錄因子則包括了c-Myc、FoxO、HIF-1α等明星分子。研究結果顯示丹參多酚酸組分、三七總皂苷組分、丹參多酚酸與三七總皂苷合用可通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路發揮藥效作用。

4.2 藥物對損傷后膠質細胞分泌神經營養因子的影響BDNF和NGF屬于神經營養因子家族，在神經元的生長和分化過程中至關重要。胰島素樣生長因子-1（IGF-1）是幾乎所有組織中都存在的多能生物活性物質。這些活躍在大腦中的分子涉及能量和葡萄糖穩態等多種調節機制，影響機體不同的病理和生理過程，包括神經元的存活、學習、記憶和損傷修復等。本實驗采用RT-PCR方法，以BDNF、NGF和IGF-1α的表達作為評價指標，發現丹參多酚酸和三七總皂苷組分及其合用對OGD/R損傷星形膠質細胞神經營養因子表達的促進作用。

關于中風病的治療藥物研究已展開多年，目前被FDA認證有效的治療藥物只有一個，即重組人纖溶酶原激活物[26]，但因受時間窗限制，臨床上真正得到治療的患者相對較少。中藥不乏活血化瘀、醒腦開竅的良藥，但因作用機制研究相對較少，使其臨床推廣應用受到限制，因此中藥的發病機制闡明是目前中藥發展和推廣中亟待解決的一大問題。本實驗研究發現，丹參多酚酸、三七總皂苷、丹參多酚酸與三七總皂苷合用可通過保護OGD/R損傷后星形膠質細胞線粒體、促進神經營養因子的表達發揮治療作用，為中藥治療中風的作用機制闡釋提供了理論依據。