不同益生菌發酵劑對復合果蔬汁品質的影響

趙榮敏

（石家莊職業技術學院食品與藥品工程系，河北 石家莊 050081）

沙棘、胡蘿卜和黑棗廣泛種植于我國北方地區，三者的果實中富含多種碳水化合物、氨基酸、維生素、脂肪酸和多種微量元素，并含有大量的黃酮和多酚等生物活性物質[1-4]。綜合三者的成分對人體十分有益，具有抗氧化、抗突變、保護胃腸道、保護肝臟、增強免疫力等作用[2-4]。這三者通常都被生食或榨汁，但由于其酸味和澀味明顯而不被人們所接受，亟需加大三者的綜合加工，提高產品的附加值。研究三者的加工工藝對于果蔬加工產業的可持續發展具有重要意義。

益生菌具有抗氧化、抗菌、抗炎及一些其它益生特性，可為宿主帶來多種益處[5]。通過發酵技術將這一至關重要的益生功能傳遞給宿主是一個非常有前景的應用。使用益生菌發酵技術研發具有保健功能的發酵果蔬汁，不僅可以增加果蔬制品的種類，還有助于提高果蔬制品的保健功效[6]。含酵母自溶物的果蔬經乳酸菌發酵后，發酵產品中礦物質、β-胡蘿卜素、甜菜苷、維生素和一些其它營養物質的含量顯著高于未發酵的果蔬[7]。此外，乳酸菌發酵橙汁可增加類胡蘿卜素和黃酮的含量[8]。

目前，對于益生菌發酵果蔬的研究報道較多，但以沙棘、胡蘿卜和黑棗為原料發酵復合果蔬汁的研究鮮有報道，且不同益生菌發酵劑及其組合對該復合果蔬汁的影響也未知。本研究以沙棘、胡蘿卜和黑棗為主要原料，基于現代發酵技術，接種不同益生菌發酵劑進行發酵，探究發酵過程中體外抗氧化能力、益生菌菌落總數、主要理化指標（pH值、總酸、可溶性蛋白、還原糖）、有機酸和活性成分（總黃酮和總多酚）含量的變化規律，同時利用相關性分析對各品質指標進行分析，為復合果蔬汁的綜合開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘原漿：呂梁野山坡食品有限責任公司；胡蘿卜汁、黑棗汁：福建綠泉食品有限公司。

乳酸細菌培養基、羥自由基清除能力檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉等（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；乙酸、草酸、蘋果酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、莽草酸、富馬酸、丙酮酸標準品（色譜純）：國家食品藥品檢測中心；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（分析純）：上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ZHJH-C1109C型無菌操作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機：長沙平凡儀器廠；AB-50型電子分析天平、FE28型pH計：瑞士Mettler-Toledo公司；UV1800型紫外可見光分光光度計：日本島津公司；Agilent 1260型液相色譜儀：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌懸液制備

試驗所用益生菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LP）和鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus，LR）均來自食品與藥品工程微生物實驗室。將乳酸菌接入乳酸細菌液體培養基進行活化，37℃培養24 h，4 500 r/min離心15 min，用無菌生理鹽水清洗沉淀，將其溶于生理鹽水中，配制成活菌數為2.1×107CFU/mL左右的菌懸液。

1.3.2 復合果蔬汁發酵工藝

將沙棘原漿、胡蘿卜汁和黑棗汁按一定比例混合，115℃滅菌20 min，冷卻至室溫（25℃）后裝入3L已滅菌玻璃瓶中，分別接種植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和它們的組合[1∶1（體積比），LP+LR]，接種量為2%菌懸液，混勻后37℃靜置發酵36 h，每隔6 h進行取樣，并立即置于-20℃保存。

1.3.3 益生菌菌落總數的測定

參照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》測定益生菌菌落總數[9]。

1.3.4 發酵過程中pH值、總酸、可溶性蛋白和還原糖的測定

使用pH計直接測定pH值；參照GB 5009.239—2016《食品酸度的測定》測定總滴定酸的含量（以乳酸計）[10]；采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白的含量[11]；參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》測定還原糖的含量（以葡萄糖計）[12]。

1.3.5 發酵過程中有機酸的測定

用高效液相色譜法測定復合果蔬汁中有機酸的含量[13]。取適量復合果蔬汁發酵液，4 500 r/min離心10 min，將離心后的上清液稀釋5倍微濾（0.45μm）過膜后待用。采用AgilentC18色譜柱，進樣量為10μL，流動相為甲醇-水-磷酸溶液（A體積比80∶15∶5；B體積比為 5∶90∶5），柱溫 30℃，柱流速 0.5 mL/min，檢測波長210nm[13]。流動相梯度洗脫條件：0～5min，A∶B=0∶100；15min，A ∶B=10 ∶90；45min～55 min，A∶B=100 ∶0；65 min～75 min，A ∶B=0 ∶100[13]。

1.3.6 發酵過程中總黃酮和總多酚含量的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮的含量[14]，總黃酮含量用蘆丁當量表示；采用Folin-Ciocalteu比色法測定總多酚的含量[15]，總多酚含量用沒食子酸當量表示。

1.3.7 發酵過程中體外抗氧化能力的測定

DPPH自由基清除能力測定參考王儲炎等[16]的方法，取適量復合果蔬汁發酵液，4 500 r/min離心10 min，將 100 μL上清液加入到 100 μL 0.2 mmol/L DPPH 甲醇溶液，混勻后置于黑暗條件下反應30 min，于517 nm下測定吸光度，分別以80%甲醇溶液和純水代替樣品作陽性對照和空白對照。DPPH自由基清除率計算公式如下。

DPPH 自由清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A0、A1和A2分別為空白、樣品和對照的吸光度值。

羥自由基清除能力測定參考LIU等[17]的方法，根據試劑盒的相應步驟進行測定。羥自由基清除率計算公式如下。

羥自由清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A0、A1和A2分別為空白、樣品和對照的吸光度值。

1.4 數據分析

每組試驗均重復3次，采用Origin 9.0軟件繪圖，方差分析（ANOVA）用于分析組間差異，SPSS 19.0軟件進行ANOVA和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中乳酸菌菌落總數的變化

復合果蔬汁發酵過程中乳酸菌菌落總數的變化見圖1。

圖1 復合果蔬汁發酵過程中乳酸菌菌落總數的變化Fig.1 Changes in the total numbers of colonies during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice

由圖1可知，復合果蔬汁發酵過程中乳酸菌菌落總數呈現先增加后趨于平緩的趨勢，與吳萬林等[18]得出的結論一致。其中，LP組在發酵6 h時乳酸菌菌落總數迅速增加至6.12lg（CFU/mL），遠高于LR組[5.54 lg（CFU/mL）]和LP+LR組[5.92 lg（CFU/mL）]（P<0.05），說明復合果蔬汁中營養物質充足，可促進乳酸菌的生長繁殖，而植物乳桿菌比鼠李糖乳桿菌更適宜該發酵環境。發酵30 h后，LP組和LR組中乳酸菌總數達到最大，分別為 8.21 lg（CFU/mL）和 8.04 lg（CFU/mL），隨后開始下降，這是因為隨著發酵時間的不斷延長，發酵體系中營養物質不斷被消耗及大量次級代謝產物的積累不利于乳酸菌的生長[19]。

2.2 發酵過程中pH值、總酸、可溶性蛋白和還原糖的變化

復合果蔬汁發酵過程中pH值、總酸、可溶性蛋白和還原糖的變化見圖2。

圖2 復合果蔬汁發酵過程中pH值、總酸、可溶性蛋白和還原糖的變化Fig.2 Changes in the pH，total acidity，soluble protein content and reducing sugar content during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice

由圖2A可知，復合果蔬汁在發酵過程中pH值呈逐漸下降的趨勢，與XU等[20]報道一致。其中，LP+LR組在發酵36 h時具有最低的pH值，為3.52，顯著低（P<0.05）于LP組和LR組，表明植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的互利共生關系有利于營養物質的消耗，促進其生長代謝，從而加速發酵環境的酸化。如圖2B所示，復合果蔬汁在發酵過程中總酸含量整體上呈先快速增加后維持穩定的趨勢，這可能是由于原料中有機酸的溶出及乳酸菌在生長代謝中產生了乳酸等有機酸[2]。隨著發酵的不斷延續，LP+LR組中總酸含量由最初的0.27 g/L增加至發酵36 h的2.04 g/L。LP+LR組發酵過程中總酸含量始終高于LP組和LR組，這與圖1的結論相吻合，產酸量與菌落總數呈正相關。由圖2C可知，復合果蔬汁在發酵過程中可溶性蛋白含量的變化趨勢與總酸含量的變化趨勢相反，與王越等[13]報道一致，這可能是由于可溶性蛋白能與脂肪、纖維素等結合形成致密且不溶于水的大分子物質，且發酵環境的不斷酸化也會導致可溶性蛋白在大量H+水解作用下分解為多肽和氨基酸[13]。其中，在發酵36 h時，LP組和LR組中可溶性蛋白含量無顯著差異（P>0.05），其含量分別為0.22 g/L和0.25 g/L，而LP+LR組中可溶性蛋白含量為0.17 g/L，顯著低（P<0.05）于LP組和LR組發酵的復合果蔬汁。如圖2D所示，復合果蔬汁在發酵過程中還原糖含量呈先增加后下降再保持穩定的變化趨勢。LP組、LR組和LP+LR組中還原糖含量分別在發酵6、12 h和6 h達到最大值，其含量分別為72.62、70.64 g/L和67.01 g/L，說明乳酸菌生長代謝過程中產生的酶可將復合果蔬汁中其它種類糖類化合物分解成還原糖，造成發酵初期還原糖含量增加。隨著發酵的進行，發酵體系中還原糖含量不斷下降，這是由于乳酸菌的快速生長需要消耗大量碳源。在發酵36 h時，3種工藝發酵復合果蔬汁中還原糖含量無顯著差異（P>0.05）。

2.3 發酵過程中有機酸的變化

復合果蔬汁的風味主要受有機酸、糖類等成分影響，其中，有機酸是影響其風味的重要指標[21]。復合果蔬汁發酵過程中有機酸的變化見表1。

表1 復合果蔬汁發酵過程中有機酸的變化Table 1 Changes in the content of organic acids during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice

由表1可知，在未發酵的復合果蔬汁中有機酸以蘋果酸為主，其含量占整個有機酸的73.54%，與陸敏等[22]研究結果相一致，但接種乳酸菌發酵會使復合果蔬汁中蘋果酸含量隨發酵時間的延長而降低。莽草酸、富馬酸和丙酮酸在3種不同工藝的復合果蔬汁發酵過程中變化均不明顯，乙酸、草酸、檸檬酸、乳酸和琥珀酸則呈先增后降的變化趨勢。復合果蔬汁發酵過程中乳酸的變化最顯著，其在未發酵的復合果蔬汁中不能被檢測，而在發酵36 h時的含量為15.78 mg/mL～16.82 mg/mL，其中，LP+LR組中乳酸含量最高，而LR組最低。此外，在發酵36 h時，LP+LR組中檸檬酸、乙酸和草酸的含量分別為6.74、1.24、0.87 mg/mL。3種工藝發酵復合果蔬汁中，除草酸含量無顯著差異（P>0.05）外，LP+LR組中乙酸含量顯著高于LP組（1.01mg/mL）和LR組（0.86mg/mL），而LR組中檸檬酸含量最高，可達7.06 mg/mL，顯著高于LP+LR組和LP組（6.47 mg/mL）。綜上可知，乳酸和檸檬酸是乳酸菌發酵復合果蔬汁中最主要的兩種有機酸，兩者之和占整個有機酸的87%左右。說明乳酸和檸檬酸是決定乳酸菌發酵復合果蔬汁口感的主要因素之一。

2.4 發酵過程中總黃酮和總多酚的變化

黃酮類化合物是一類廣泛存在于果蔬中的天然有機化合物，具有抗氧化、抗炎及抗菌等多種生物活性。復合果蔬汁發酵過程中總黃酮和總多酚的變化見圖3。

圖3 復合果蔬汁發酵過程中總黃酮和總多酚的變化Fig.3 Changes in total flavonoids contents and total polyphenol contents during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice

如圖3A所示，復合果蔬汁在發酵過程中總黃酮含量整體上呈先增加后維持穩定的趨勢，這是因為乳酸菌在生長過程中會產生各種酶，這些酶會促進纖維素、果膠等大分子物質的分解，使大量黃酮類化合物溶于發酵體系中，從而提高果蔬汁中總黃酮的含量[23]。當發酵進行30 h后，3種工藝發酵果蔬汁的總黃酮含量趨于穩定，其中LP+LR組發酵的復合果蔬汁中總黃酮含量最高，為0.45 g/L，而LP組發酵的復合果蔬汁中總黃酮含量最低，為0.35 g/L，LR組發酵的復合果蔬汁中總黃酮含量介于兩者之間，為0.41 g/L，顯著高于LP組（P<0.05）。結合圖1的結論可知，在復合果蔬汁發酵體系中鼠李糖乳桿具有比植物乳桿菌更強的合成黃酮類化合物的能力。

復合果蔬汁的顏色、味道等感官特性也受多酚類物質含量的影響[24]。由圖3B可知，復合果蔬汁在發酵過程中總多酚含量整體上呈先增加后下降的趨勢，這主要是因為隨著發酵過程中單體酚類化合物的生物合成，促進總多酚含量的增加，而酚類物質的氧化與生成也是同時進行的，到了發酵后期，生成的速率降低，而氧化過程仍在繼續，導致酚類物質的減少[13,25]。在發酵30 h時，LP+LR組發酵的復合果蔬汁中總多酚含量達到最高，為12.22g/L，顯著高于LP組（9.92g/L）和LR組（10.58 g/L）（P<0.05）。此外，乳酸菌發酵復合果蔬汁可顯著提高（P<0.05）總多酚含量，比未發酵的復合果蔬汁增加了74%～113%，表明發酵技術有利于增加復合果蔬汁多酚類生物活性物質的含量。

2.5 發酵過程中體外抗氧化能力的變化

復合果蔬汁發酵過程中體外抗氧化能力的變化見圖4。

圖4 復合果蔬汁發酵過程中體外抗氧化能力的變化Fig.4 Changes in antioxidant activity during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice

如圖4所示，復合果蔬汁在發酵過程中DPPH自由基清除率和羥自由基清除率整體上均呈現先上升后下降的趨勢。3種工藝的DPPH自由基清除率均在發酵30 h達到最大，其中，LP+LR組的DPPH自由基清除率最大，可達91.57%，而LP組的DPPH自由基清除率最低，為88.03%，LR組的DPPH自由基清除率介于兩者之間，為88.98%。此外，3種工藝的羥自由基清除率最大值則出現在發酵24 h，其中，LP+LR組的羥自由基清除率最大，為71.57%，顯著高（P<0.05）于LP組（66.43%）和LR組（67.98%）。這可能與乳酸菌的代謝產物及復合果蔬汁中活性物質的變化有關[26]。綜上，植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌耦合發酵可明顯改善復合果蔬汁的體外抗氧化能力。

3 結論

本文使用不同益生菌及其組合發酵以沙棘、胡蘿卜和黑棗為原料制備的復合果蔬汁，探究復合果蔬汁發酵過程中關鍵理化性質、有機酸、總黃酮和總多酚類活性物質及體外抗氧化能力等的變化規律。結果表明，相比直接利用植物乳桿菌或鼠李糖乳桿菌發酵復合果蔬汁，植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌耦合發酵可顯著增加（P<0.05）乳酸菌的菌落總數，并提高（P<0.05）總酸、總黃酮、總多酚、乙酸和乳酸等物質的含量及增加（P<0.05）體外抗氧化活性。3種工藝發酵復合果蔬汁中還原糖含量無顯著差異。本研究不僅豐富了復合果蔬汁的產品種類，還為乳酸菌發酵復合果蔬汁的加工和生產提供數據支持。