適配體調控高SERS活性金納米檢測多菌靈

陳海霞，羅楊合，龐永豐，聶輝，黃雙全，黎小椿

（賀州學院食品與生物工程學院，廣西 賀州 542899）

多菌靈是常用的苯并咪唑類殺菌劑，其通過種子、根、葉吸收后在作物體內傳導，起到治療和保護作用，殘留時效長。由于人們過量使用多菌靈，使得農產品及其加工品受到污染，對人畜安全健康帶來負面影響，甚至導致環境污染。因此，建立穩定性好、靈敏度高的蔬菜中多菌靈快檢方法對保障蔬菜質量安全尤為重要。

近年來，蔬菜農殘多菌靈快速檢測常用的方法有高效液相色譜法[1]、液相色譜串聯質譜法[2]、近紅外光譜法[3]、紫外吸收光譜法[4]、熒光法[5]、表面增強拉曼光譜法[6-7]。高效液相色譜法、液相色譜串聯質譜法樣品處理復雜，操作繁瑣；近紅外光譜法和紫外吸收光譜法易受干擾、檢測限低。與紅外、熒光等其它光譜手段相比，表面增強拉曼光譜法的優點在于可用紅外光激發、受生物樣品自身熒光干擾更小、不受水干擾以及不易猝滅，它的檢測范圍更寬、靈敏度更高、提供更多信息等優點，是一種非常好的蔬菜農殘快速檢測方法。

表面增強拉曼散射（surface-enhanced raman scattering，SERS）光譜是一種非破壞性、靈敏度高、選擇性好的拉曼光譜分析技術。SERS效應是在激發區域內，由于樣品分子吸附在一定程度粗糙表面上，使表面或近表面的電磁場的增強，導致拉曼散射信號極大增強（約106～1010）。SERS技術操作簡便，選擇好，不需要進行復雜的樣品前處理，適用于現場快速檢測。它還克服了拉曼光譜精確度低、信號弱、背景干擾強的缺點，可以獲取到常規拉曼光譜難易得到的結構信息，可以有效分析化合物在界面的吸附取向、吸附態的變化、界面信息等優勢，已被廣泛應用于檢測農藥殘留[8]、痕量重金屬等[9]。Shende等[10]采用SERS法檢測水果中的農藥殘留，檢測限達10-6mol/L。Vongsvivut等[11]制備金-銀金納米溶膠作SERS基底檢測地蟲磷農藥殘留，檢出限為10mg/mL。Tang等[12]以銀納米粒子作為基底，通過SERS技術測定三環唑和百草枯和氟硅混合農藥，三環唑的檢出限為0.01mg/L，百草枯的檢出限為0.1mg/L，氟硅唑的檢出限為2.85 mg/L。但是，SERS活性基底的制備和方法的選擇性還有很多問題需要解決。因此，制備穩定性、重現性較好的SERS基底，建立快速、準確、靈敏、穩定的蔬菜農殘SERS定量分析方法具有重要研究意義。

金納米（gold nanoparticles，AuNPs）是一種能與其它生物大分子結合且不影響其生物活性的納米材料。AuNPs可與氨基非共價鍵吸附，也能與巰基共價結合，因此它可以和多種生物傳感器相互結合，形成穩定性好的納米復合探針，可以識別多種靶目標，提高檢測的靈敏性。倪璇等[13]通過利用檸檬酸三鈉的還原性還原氯金酸制備AuNPs，建立了一種比色適配體傳感器檢測水溶液中的多菌靈的新方法，該比色法的檢測限低至2.3nmol/L，線性檢測范圍為2.3 nmol/L～800 nmol/L。陳雨等[14]使用SERS技術研究DNA-AuNPs組裝體對γ射線的輻射響應性質，以及金納米粒子的局域增強效應對組裝體γ射線響應的影響。蔣巧艷等[15]利用AuNPs、MoS2和鈦合金箔為材料構建表面增強基底物用于敵草快（diguat dibromide，DQ）的檢測，建立了一個新穎、靈敏的SERS檢測DQ方法，結果顯示該方法的檢出限為10-13mol/L，比現有報道的DQ檢測方法的檢出限（10-12mol/L）低。但是，不同直徑的納米金有不同的性質，因此，制備合適的納米金尤為重要。

適配體（aptamer，Apt）是通過指數富集系統（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術從體外隨機單鏈DNA或RNA序列庫中篩選出來的能與靶物質產生類似于抗原-抗體高特異性結合的寡核苷酸鏈。隨著生物技術的發展，自1990年Ellington首次提出適配體概念后，基于其親和力及與靶物質特異性結合能力，作為靈敏檢測農藥殘留的新方法得到了快速發展。李鳳球等[16]提到被篩選出來并應用于實際農殘檢測的適配體很少，迄今為止還不足20種。聶永惠[17]以納米金溶膠為SERS活性基底，基于適配體與馬拉硫磷特異結合的能力，建立了一種簡單且針對馬拉硫磷的特異檢測的SERS的快速無損檢測方法，該法在 5×10-7mol/L～1×10-5mol/L 范圍內具有良好線性關系，相關系數值R2=0.992 0。胡薇薇[18]以結晶紫為探針，在啶蟲脒存在時，核酸適配體能與其發生特異性結合并不再吸附到結晶紫-金納米離子表面而使SERS信號降低的規律，構建表面增強拉曼納米生物傳感器對茶葉中啶蟲脒進行定量檢測，檢出限為0.72 nmol/L。Zourob等[19]利用SELEX技術在10輪篩選后，成功篩選出高適應性和特異性的多菌靈DNA適配體。將該適配體經過硫醇修飾在金電極上自組裝構建電化學適體傳感器對多菌靈進行檢測。由于適配體只有在一定條件下才能與其靶物質發生特異結合，且同一適配體不能與多種靶物質發生特異反應，因此需要根據實際測定的目標物選擇適宜的適配體。

目前，基于適配體的比色傳感檢測多菌靈的方法已經建立，但是未見基于適配體與納米結合，建立SERS法檢測多菌靈的相關報道。因此，本文利用適配體的高親和力及特異結合性能，建立穩定性高、選擇性好、快速檢測多菌靈的SERS分析方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試驗用水均為超純水（電阻：18.25 MΩ·cm）。所用玻璃器皿均用王水浸泡，超純水清洗。

1.1.1 儀器

633 nmDXRsmart激光拉曼光譜儀：美國Thermo公司；MR-Hei-Tec加熱型磁力攪拌器：德國Heidolph公司；Evolution 300紫外可見光分光光度計：廣西金鑫進出口有限公司；F-4600熒光分光光度計：廣西思遠儀器設備有限公司；ULUP-II-40L優普系列超純水器：四川優普超純科技有限公司；FA2004N分析天平：上海菁海有限公司；H 1650臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.1.2 試劑

氯金酸（AR）：國藥集團化學試劑有限公司；檸檬酸三鈉（AR）、碳酸氫鈉（AR）、氯化鋅（AR）：成都市科龍化工試劑廠；氯化鈉（AR）：廣州化學試劑廠；維多利亞藍B（AR）：匯普化工有限公司；多菌靈適配體；生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇中多菌靈（100μg/mL）、丙酮中毒死蜱（100μg/mL）、丙酮中莠去津（100 μg/mL）、乙醇中吡蟲啉（1 000 μg/mL）：北京壇墨質檢科技有限公司；氯化鋇（AR）、硫酸鉀（AR）、丙酮（AR）、乙醇（95%）：西隴科學股份有限公司；甲醇（AR）：廣東光華科技股份有限公司。

1.1.3 試驗試劑的配制

1%氯金酸（HAuCl4）溶液：將1 g氯金酸在燒杯中用超純水溶解，于100 mL棕色容量瓶定容，4℃冰箱貯藏。

1%檸檬酸三鈉溶液：稱量1 g檸檬酸三鈉，放入小燒杯中，用超純水溶解，于100 mL棕色容量瓶定容至刻度，常溫貯藏即可。

1 mol/L NaCl溶液：稱量5.58 g NaCl在燒杯中用超純水溶解，于100 mL容量瓶定容，常溫貯藏。

1×10-5mol/L維多利亞藍B溶液（victoria blue B，VBB）：稱量0.506 g維多利亞藍B在燒杯中溶解，100 mL棕色容量瓶定容，得到1×10-3mol/L VBB溶液，再逐級稀釋成1×10-5mol/L，4℃冰箱貯藏。

多菌靈標準液（carbendazim，CBZ）：量取1 mL 100 μg/mL（100 mg/L）的甲醇中多菌靈標準液，放入10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到10 mg/L的多菌靈溶液，4℃冰箱冷藏備用。

多菌靈適配體溶液：將含有18 μmol/L適配體的離心管離心（10 000 r/min）1 min，加入 100 μL 超純水繼續離心1 min，逐級稀釋成0.18 μmol/L適配體溶液，4℃冰箱冷藏備用。

毒死蜱溶液、莠去津溶液、吡蟲啉溶液：直接用移液槍量取購買的原液即可。

氯化鋇溶液、硫酸鉀溶液、丙酮溶液、乙醇溶液、甲醇溶液、碳酸氫鈉溶液、氯化鋅溶液：準確稱量并配制1 mol/L即可。

1.2 試驗方法

1.2.1 AuNPs的制備

取120 mL超純水在攪拌的條件下（660 r/min）加熱至沸騰，然后依次加入7 mL 1%檸檬酸三鈉溶液和1 mL 1% HAuCl4溶液，繼續攪拌加熱20 min，顏色變化為：無色→淺紫色→紫色→紫紅色→酒紅色。停止加熱，繼續攪拌至室溫（25℃）。然后移入100mL棕色容量瓶，定容，得到AuNPs溶液濃度為47.8 μg/mL，放4℃冰箱備用。

1.2.2 CBZ檢測方法

用移液槍量取6.00 mmol/L AuNPs溶膠于5 mL的小試管中，加入27.00 nmol/L的多菌靈適配體混合均勻，靜置5 min后加入0～1040 nmol/L的多菌靈、5.00 mmol/L NaCl和0.25 mmol/L VBB，然后定容到2 mL，將反應液放入比色皿中，測定1 618 cm-1處的SERS峰強度I，I0是不加CBZ的空白試驗組，計算ΔI=I0-I。每個試驗組均進行3次平行測定。

2 結果與分析

2.1 體系檢測原理

用檸檬酸三鈉還原HAuCl4溶液制備出酒紅色的AuNPs為基底，以VBB為探針分子，當體系不存在多菌靈時，AuNPs被適配體包裹，以VBB與AuNPs的基礎面積減少，體系在1 618 cm-1處SERS信號強度下降。加入多菌靈后，多菌靈與適配體特異性結合形成穩定的復合物，裸露在溶液中的AuNPs與VBB接觸面增大，體系在1 618 cm-1SERS信號強度上升，據此建立多菌靈的SERS檢測體系（如圖1）。

圖1 檢測原理圖Fig.1 Detection schematic diagram

2.2 透射電鏡表征高活性AuNPs

通過透射電鏡（TEM）掃描酒紅色的AuNPs溶膠（見圖2），結果（見圖3）表明所制備的AuNPs形狀是球形的，其平均直徑是20 nm。球形金納米比表面積較高、穩定性好。

圖2 AuNPs溶膠Fig.2 AuNPs sol

圖3 AuNPs透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscopy of AuNPs

2.3 多菌靈-適配體-AuNPs體系SERS光譜

多菌靈-適配體-AuNPs體系SERS光譜見圖4。

圖4 多菌靈-適配體-AuNPs體系SESR光譜Fig.4 SERS spectra of CBZ-Apt-AuNPs system

當體系沒有多菌靈時，由于AuNPs被適配體包裹，在1 618 cm-1處出現較弱的SERS特征峰。當加入多菌靈后，多菌靈與適配體特異性結合成穩定的復合物，AuNPs被釋放，與VBB接觸面增大，在1 618 cm-1處有較強的SERS特征峰，隨著多菌靈濃度的增加，1 618 cm-1處的SERS特征峰呈線性關系。

2.4 紫外—可見光吸收光譜

AuNPs紫外—可見光吸收光譜見圖5。

圖5 AuNPs紫外-可見光吸收光譜Fig.5 UV-Vis absorption spectrum of AuNP

由圖5a曲線可以得出AuNPs溶膠紫外吸收峰范圍在520 nm～530 nm之間，納米為球形納米，與電鏡圖相符。圖5b為多菌靈-多菌靈適配體-AuNPs體系結合的結果。加入多菌靈后，多菌靈-適配體-AuNPs復合體增加，NaCl聚集作用減弱從而減少淡藍色聚集體，體系呈紅色，故在520 nm～530 nm范圍的吸收峰增強，與SERS光譜一致。

2.5 共振瑞利散射（RRS）光譜

AuNPs RRS光譜見圖6。

圖6 AuNPs RRS光譜Fig.6 RRS spectrum of AuNPs

在圖6a曲線可以看到AuNPs溶膠在290、369、445、520 nm處都有RRS峰。隨著多菌靈的加入（見圖6b），多菌靈-適配體-AuNPs復合體增加，導致AuNPs這4個RRS峰峰值降低，與SERS光譜結果一致。

2.6 體系影響因素的優化

不同濃度下各因素對體系的影響見圖7。

圖7 不同濃度下各因素對體系的影響Fig.7 Effects on the system of various factors at different concentrations

分別對影響體系的AuNPs、NaCl、VBB及適配體等因素進行優化，由試驗結果可知，當AuNPs、NaCl、VBB及適配體的濃度分別為 6.00、5.00、0.25、27.00 nmol/L時，體系的SERS信號最強，故最終選取AuNPs、NaCl、VBB及適配體的最佳濃度分別為 6.00、5.00、0.25、27.00 nmol/L以進行下一步試驗。

2.7 干擾物質的影響

專一的適配體與特定靶物質會發生特異性結合，從而實現目標靶物質的檢測。在優化好的檢測體系中加入156 nmol/L的多菌靈后，分別加入10種常見的干擾物質對體系進行干擾試驗。常見干擾物質對體系的影響見表1。

表1 常見干擾物質對體系的影響Table 1 Influence of common interfering substances on the system

由表1可知，1.75×105nmol/L的丙酮溶液、乙醇溶液、甲醇溶液、BaCl2溶液、K2SO2溶液、NaHCO3溶液及ZnCl2溶液不干擾測定，1.56×104nmol/L的莠去津溶液、吡蟲咪溶液、毒死蜱溶液不干擾測定，說明該法具有較高的選擇性。

2.8 工作曲線

為了研究這種用適配體包裹AuNPs從而進行定量檢測多菌靈濃度的可行性，通過分析不同濃度下多菌靈的SERS信號強度變化趨勢。將反應體系SERS信號強度對多菌靈濃度作圖，得到擬合曲線。反應體系檢測多菌靈的靈敏度分析見圖8，反應體系檢測多菌靈的工作擬合曲線見圖9。

圖8 反應體系檢測多菌靈的靈敏度分析Fig.8 Sensitivity analysis of carbendazim in the reaction system

圖9 反應體系檢測多菌靈的工作擬合曲線Fig.9 Work fitting curve of carbendazim detection by reaction system

如圖8所示，隨著多菌靈濃度的增加，反應體系的SERS信號不斷增強，在到達一定濃度（520nmol/L）后無上升趨勢，甚至開始下降。如圖9所示，在多菌靈較低濃度下（0～520 nmol/L），SERS信號強度的增值與多菌靈濃度的線性擬合曲線，其線性方程為y=4.4394x+67.523，相關系數R2=0.998 8，最低檢出限為4.13 nmol/L，說明該法具有較好的靈敏性。

3 結論

通過利用檸檬酸三鈉的還原性可快速制備酒紅色球形金納米 AuNPs，AuNPs在NaCl作用下發生聚集，以VBB為探針分子，體系在1 618 cm-1處表現出較強的SERS特征峰。當加入多菌靈適配體時，AuNPs被包裹，形成AuNPs適配體結合體，VBB與AuNPs接觸面減少，1 618 cm-1處的SERS特征峰信號降低。當加入CBZ時，CBZ與適配體特異性結合形成穩定的復合物，從而使AuNPs被釋放，體系SERS信號增強。隨著CBZ濃度的增加，AuNPs被釋放得越多，體系SERS峰信號越強。通過優化條件后，CBZ在6.5 nmol/L～520 nmol/L濃度范圍內，其SERS信號強度變化值表現出良好的線性關系，y=4.4394x+67.523，線性范圍R2=0.998 8。建立的方法靈敏度高、選擇性好，有望運用于果蔬中農藥殘留的檢測。