甜葉菊花和葉中酚類成分分析及含量測定

謝虹，陳云，梁建生

（揚州大學生物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009）

甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni）為菊科（Compositae）斯臺比亞屬（Stevia）多年生草本植物，因葉片中含有低熱值和高甜度的甜菊糖苷（steviol glycosides，SGs）而得到人們的高度關注[1]。SGs是一類二萜糖苷類化合物的總稱，甜度約為蔗糖甜度的300倍，因而作為一種天然來源的“甜味劑”被廣泛應用于食品和飲料工業[2]。SGs還可治療糖尿病、牙科疾病、肥胖病、高血壓和癌癥等疾病[3-4]。甜葉菊中含有30多種濃度各異的SGs，其中甜菊苷（stevioside，St）和瑞鮑迪苷A（rebaudiosideA，RA）含量最豐富[5]。研究表明，酚類是甜葉菊中另一類含量豐富的活性物質，甜葉菊中酚類主要有酚酸和類黃酮兩類，而酚酸主要包括綠原酸類化合物[6]。國內對甜葉菊酚類的研究多集中在葉片綠原酸類化合物含量的測定方面[7-9]，而有關類黃酮成分分析及含量測定研究較少。

甜葉菊屬于短日照植物，在長日照下只有長莖葉進行營養生長。當日照逐漸縮短，其才能現蕾開花進入生殖生長階段[10]。以St含量高的甜葉菊品種為材料的研究表明SGs含量在現蕾初期達到最高，開花后SGs含量明顯下降[11]，因此甜葉菊產地多以田間群體10%～20%的植株現蕾作為最適采收期[12]，因而產業界至今未挖掘甜葉菊花的經濟價值。上世紀末，甜葉菊栽培品種隨著市場需求經歷了從高St向高RA含量及高RA/St比的品種更替，羅慶云等[11]的研究結果表明高RA甜葉菊品種葉的采收可在現蕾至種子成熟時段進行。作為植物精華的鮮花除具有觀賞價值外，還含有豐富的類黃酮、酚酸、氨基酸、微量元素和維生素等活性成分，具有食用和藥用價值[13]。本文以甜葉菊的花和葉為研究對象，鑒定其酚類成分并測定含量，為建立甜葉菊多指標質量評價體系和擴大甜葉菊開發應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甜葉菊花（去苞片）、葉片：江蘇寶蓮生物科技有限公司甜葉菊種植基地，55℃過夜烘干后研磨成細粉，過50目篩，備用。

1.2 試劑與儀器

新綠原酸、隱綠原酸、1，3-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對照品：成都曼思特生物科技有限公司；槲皮素-7-O-葡萄糖苷對照品：上海源葉生物科技有限公司；木犀草素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷對照品：索萊寶生物科技有限公司；綠原酸、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蘆丁對照品：成都瑞芬思生物科技有限公司；槲皮素-3-O-木糖苷、山奈酚-3-O-鼠李糖苷、山奈酚3-O-阿拉伯糖苷對照品：四川省維克奇生物科技有限公司。以上對照品均為色譜純（質量分數均大于98%）。甲酸（色譜純）：天津科密歐化學試劑有限公司；乙腈（色譜純）：瑞典OCEANPAK公司；甲醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；固相萃取試劑盒（2 mL）：安捷倫科技有限公司。

高效液相色譜（1260）-串聯四極桿質譜分析儀（6460Triple Quad LC/MS）、高效液相色譜儀（1200）：安捷倫科技有限公司；電子天平（AL204）：梅特勒-托利多公司；電熱鼓風干燥箱（DHG-9141A）：德國美墨爾特公司；冰凍離心機（5804R）：德國艾本德公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試品溶液

分別稱取甜葉菊的花粉末5.00 g和葉粉末1.00 g，各加入30 mL甲醇，超聲輔助浸提30 min，6 000 r/min離心10 min，取上清，沉淀加入30 mL甲醇超聲輔助重復浸提2次，每次30 min，合并3次浸提的上清液并定容至100 mL，得甲醇浸提液。取1 mL浸提液置于固相萃取試劑盒中旋渦振蕩3 min，9 000 r/min離心8 min，取上清用10%乙腈稀釋至合適的濃度，過0.22 μm微孔濾膜，得供試品溶液。

1.3.2 高效液相色譜-質譜鑒定酚類化合物

1）液相色譜條件：色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5%甲酸水（B），梯度洗脫程序（0～5 min，5%～10%A；5 min～40 min：10%～34%A；40 min～45 min，34%～95%A；45 min～47min，95%A；47 min～48 min，95%～5%A；48 min～60 min，5%A）；流速：0.3 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2）質譜條件：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），正/負離子掃描檢測模式；掃描范圍 m/z：50～1 000；毛細管電壓：4 kV（正）、3.5 kV（負）；干燥氣體溫度：300℃，干燥氣體流速：10 L/min；鞘氣溫度：132℃，鞘氣流速：7 L/min；霧化器壓力：103 kPa。

1.3.3 高效液相色譜法檢測酚類含量

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：SepaxGP-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：0.5%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序（0～5 min，5%～10%B；5 min～40 min：10%～34%B；40min～44min，34%～95%B；44min～48 min，95%～5%B）；流速：0.9 mL/min；檢測波長：330 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

1.3.3.2 線性關系

精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、1，3-二咖啡酰奎寧酸、蘆丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、異綠原酸B、異綠原酸A、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷、異綠原酸C、山奈酚-3-O-鼠李糖苷15個對照品適量，置于25 mL容量瓶中，加甲醇超聲輔助溶解定容后得混合對照品溶液，用10%乙腈溶液按比例稀釋成相應的濃度梯度進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。

1.3.3.3 精密度、重復性、穩定性和加樣回收率試驗

取“1.3.3.2”項下制備混合對照品溶液重復進樣5次，以峰面積計算15種酚類的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值評估儀器精密度。取甜葉菊樣品按“1.3.1”項下方法制備供試品溶液，平行5份，按“1.3.3.1”項下色譜條件進行測定，以峰面積計算15種酚類的RSD值評估該方法重復性。取甜葉菊供試品溶液，分別于 0、4、8、12、24 h 進行測定，以峰面積計算 15種酚類的RSD值評估供試品溶液穩定性。精密稱取已知含量的同一批樣品適量，共9份，每3份為一組，分別精確加入低、中、高濃度的對照品溶液適量，按“1.3.1”項下方法制備供試品溶液，再按“1.3.3.1”項下色譜條件進行測定并計算加樣回收率。

1.3.3.4 甜葉菊花和葉中酚類含量測定

以2019年種植的甜葉菊一新品種盛花期（生長160 d）10個植株混合葉和混合花為材料，按“1.3.1”項下方法制備供試品溶液，并按“1.3.3.1”項下色譜條件進行測定，采用外標法計算酚類含量（平行測定3份，取平均值）。因無木犀草素-7-O-蕓香糖苷的對照品，其含量的計算以木犀草素-7-O-葡萄糖苷的峰面積及濃度為基準，計算公式如下。

含量/（mg/g）=（C/W）×（A2/A1）×1.33

式中：C為木犀草素-7-O-葡萄糖苷對照品的濃度，mg/mL；A1為木犀草素-7-O-葡萄糖苷對照品峰面積；W為樣品的干質量，g；A2為樣品中木犀草素-7-O-蕓香糖苷峰面積；1.33為木犀草素-7-O-蕓香糖苷與木犀草素-7-O-葡萄糖苷分子質量之比。

1.4 數據處理

試驗數據使用Microsoft excel軟件和SPSS16.0統計分析軟件進行整理與分析。

2 結果與討論

2.1 甜葉菊中酚類物質的鑒定

試驗采用正/負離子模式對甜葉菊的葉和花中提取成分進行掃描，圖1是樣品在正/負模式下的質譜總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）。

圖1 甜葉菊供試品總離子流圖Fig.1 TIC of sample of Stevia rebaudiana Bertoni

峰1、2和3的分子離子峰[M-H]-均為m/z 353，初步判斷為單咖啡酰奎寧酸。3個峰的特征離子m/z191和m/z179分別為失去咖啡酸部分和奎寧酸部分的碎片離子，m/z 173為奎寧酸進一步失去H2O的碎片離子；咖啡酸可以和奎寧酸的1、3、4和5位上的羥基（-OH）脫水縮合，形成4種單咖啡酰奎寧酸。峰4、10、11和15的分子離子峰 [M-H]-均為m/z 515，特征離子m/z 353為失去咖啡酸及進一步失去H2O的碎片離子，初步判斷這4個峰均為二咖啡酰奎寧酸；兩分子咖啡酸與奎寧酸脫水縮合，理論上與奎寧酸羥基（-OH）結合位置可能有 1，3-、1，4-、1，5-、3，4-、3，5-和 4，5-六種[14]。通過參閱參考文獻[1-2,6]及對照品確定峰1、2、3、10、11、15分別為新綠原酸（3-咖啡酰奎寧酸）、綠原酸（5-咖啡酰奎寧酸）、隱綠原酸（4-咖啡酰奎寧酸）、異綠原酸 B（3，4-二咖啡酰奎寧酸）、異綠原酸 A（3，5-二咖啡酰奎寧酸）、異綠原酸C（4，5-二咖啡酰奎寧酸）。另外，根據張維冰等[14]的文獻、峰的保留時間及對照品確定峰4為1，3-二咖啡酰奎寧酸。在以往的研究中尚未見甜葉菊中含有1，3-二咖啡酰奎寧酸的報道[1,2,6-9]。

峰5、6、9和12均含有特征離子m/z 303，推測是槲皮素糖苷化合物。峰5的分子離子峰 [M-H]-為m/z 609，特征離子m/z 611和m/z303分別為[M+H]+和失去了蕓香糖（葡萄糖+鼠李糖）的碎片離子；峰6分子離子峰[M-H]-為m/z 463，特征離子m/z 465和m/z303分別為[M+H]+和失去了半乳糖或葡萄糖的碎片離子；峰9分子離子峰[M-H]-為m/z 433，特征離子m/z 303為[M+H]+失去了木糖的碎片離子；峰12分子離子峰[M-H]-為m/z 447，特征離子m/z 449和m/z303為[M+H]+和失去了鼠李糖的碎片離子。Barroso等[6]通過高效液相色譜串聯質譜技術鑒定到了葡萄牙產甜葉菊中槲皮素糖苷化合物包括蘆丁、槲皮素-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷。

峰7、8、14和16的均含有特征離子m/z 287，推測可能是木犀草素或山奈酚糖苷化合物。由于木犀草素的極性大于山奈酚的極性，所以在反相液相色譜分離中，一般木犀草素糖苷化合物的保留時間小于山奈酚糖苷化合物的保留時間，因此可以初步判斷峰7和8為木犀草素糖苷化合物。峰7的分子離子峰[M-H]-為m/z 447，特征離子m/z 287為[M+H]+失去了半乳糖或葡萄糖的碎片離子。峰8的分子離子峰[M-H]-為m/z 593，特征離子m/z 595和m/z287分別為[M+H]+和失去了雙糖的碎片離子。Ciulu等[2]在甜葉菊的酚類鑒定研究中推測[M-H]-為m/z 593的分子離子峰可能是木犀草素-7-O-蕓香糖苷或山奈酚-3-O-蕓香糖苷，本研究以分子量同為594的木犀草素-7-O-新橙皮糖苷和山奈酚-3-O-蕓香糖苷對照品進行HPLC分析，山奈酚-3-O-蕓香糖苷峰的出峰時間比峰8的出峰時間滯后2.175 min，而木犀草素-7-O-新橙皮糖苷比峰8的出峰時間提前0.971 min，因此判斷峰8應為木犀草素-7-O-蕓香糖苷。峰14和16的分子離子峰[M-H]-分別為m/z 417和m/z 431，特征離子m/z 287為[M+H]+失去了阿拉伯糖和[M+H]+失去了鼠李糖的碎片離子。峰13的分子離子峰[M-H]-為m/z 431，特征離子m/z 271為[M+H]+失去了半乳糖或葡萄糖的碎片離子。

本研究通過對照品確定峰 5、6、7、8、9、12、13、14、16分別為蘆丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-鼠李糖苷。

2.2 色譜條件的選擇

鑒于植物提取物成分多而復雜，為了有效進行組分分離，必須對分離條件進行優化，不同的分離參數包括色譜柱、流動相組成和檢測波長等需通過試驗確定。本試驗比較了Agilent Eclipse XDB、Dubhe、Sepax GP、Welch Ultimate XB、Thermo scientific ODS Hypersil、DikMa Diamonsil等C18色譜柱的分離效果，結果表明采用Sepax GP-C18色譜柱，分離效果最好。從正/負離子模式下甜葉菊樣品的總離子流圖中提取200 nm～440 nm波長范圍內的色譜圖進行比較，如圖2所示。

圖2 對照品和甜葉菊供試品高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances and Stevia rebaudiana Bertoni samples

由圖2可知，大多數峰在330nm處有最大吸收。對高效液相流動相的組成進行考察，結果表明使用乙腈-水溶液作為流動相組成比甲醇-水溶液流動相組成的分離效果好，在流動相中加入少量的甲酸，色譜峰更尖銳，并能有效減少色譜峰拖尾現象的產生。以乙腈-0.5%甲酸作為流動相，調整流動相比例，在40 min內可以實現多種成分的有效分離。

2.3 線性關系考察

將15種酚類對照品混合溶液配制成相應的濃度梯度后，進樣分析，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制系列標準曲線，15種酚類的相關系數R2為0.999 0～1，線性良好，結果見表1。

表1 15種酚類化合物的回歸方程、相關系數和線性范圍Table 1 Regression equation，correlation coefficien and linear range of fifteen phenolic compounds

2.4 精密度、重復性、穩定性和加樣回收率試驗

精密度試驗中15種酚類的RSD值在0.17%～1.56%之間，表明該儀器精密度良好；重復性試驗中15種酚類的RSD值在0.80%～1.35%之間，表明該方法重復性良好；穩定性試驗中該15種酚類的RSD值在0.76%～2.31%之間，表明供試品溶液在24 h內保持穩定；加樣回收率試驗中15種酚類的平均回收率在85.60%～98.80%之間。

2.5 甜葉菊花和葉中酚類化合物含量測定

甜葉菊花和葉中酚類化合物含量的檢測結果見表2。

表2 甜葉菊花和葉中酚類化合物含量的檢測結果Table 2 Detection results of phenolic compounds contained in flower and leaf of Stevia rebaudiana Bertoni

由表2可以看出，甜葉菊葉片中含量最高的酚酸化合物為異綠原酸A，其次是綠原酸，而異綠原酸B、新綠原酸、隱綠原酸含量較少，1，3-二咖啡酰奎寧酸含量最低；花中同樣是異綠原酸A含量最高，綠原酸的含量次之，而異綠原酸C和異綠原酸B的含量相當，隱綠原酸和1，3-二咖啡酰奎寧酸含量較少。花和葉中酚酸總量分別達到（14.61±0.25）mg/g和（71.42±2.01）mg/g。

甜葉菊花和葉的類黃酮主要以類黃酮苷的形式存在，為槲皮素、木犀草素、山奈酚以及芹菜素的糖苷衍生物。在葉片中，除了山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷和山奈酚-3-O-鼠李糖苷的含量少于花中的含量，其他7種黃酮苷的含量均高于花中的含量，花和葉均以槲皮素-3-鼠李糖苷的含量最高。花和葉中類黃酮總量分別達（7.70±0.26）mg/g和（19.69±0.31）mg/g。

自Karak?se等[15]采用液相色譜串聯質譜在甜葉菊葉發現了24種酚類化合物后，Barroso等[6]采用HPLC法測定葡萄牙產甜葉菊葉片中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的含量分別為 0.55%、5.10%、0.29%、0.55%、4.92%、1.08%，綠原酸類總量達12.49%；郭志龍等[9]采用HPLC檢測國內14個甜葉菊品種葉片中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的最高含量分別為 0.46%、3.29%、0.31%、0.32%、5.43%、1.95%，綠原酸類成分總量最高的品種可達9.78%。上述研究均顯示甜葉菊中酚酸化合物主要包括6種綠原酸類，其中主要成分均為綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C，綠原酸類成分是甜葉菊中一類含量較高的次生代謝產物，這一結論在本研究的甜葉菊品種中也成立（表2）。關于甜葉菊類黃酮化合物，Barroso等[6]通過HPLC-質譜鑒定出了蘆丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷，推測了1種槲皮素糖苷化合物及4種山奈酚糖苷化合物，并指出類黃酮化合物中以槲皮素-3-O-鼠李糖苷含量最高（9.29 mg/g），這一結果在本研究中得以驗證；本研究除了同樣鑒定出了蘆丁、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷外，還鑒定出了2種山奈酚、2種木犀草素和1種芹菜素的糖苷化合物，但沒有鑒定出槲皮素-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-葡萄糖苷，這或許是甜葉菊品種的差異所導致的。

3 結論

本研究通過高效液相色譜串聯質譜鑒定了甜葉菊花和葉中的16種酚類物質，包括新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、1，3-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C等7種酚酸化合物和蘆丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-鼠李糖苷等9種類黃酮化合物。

本研究建立了HPLC同時測定甜葉菊花和葉中16種酚類含量的方法，運用該方法測定了花和葉中的酚類化合物的含量。花和葉中酚酸化合物均以異綠原酸A的含量最高，1，3-二咖啡酰奎寧酸含量最少。花和葉中類黃酮化合物均以槲皮素-3-O-鼠李糖苷的含量最高，花中以芹菜素-7-O-葡萄糖苷含量最少，而葉中以槲皮素-3-O-木糖苷含量最少。花和葉中含有豐富的酚類化合物，甜葉菊的葉可以作為提取酚類成分的原料，而甜葉菊的花可以開發成為新型保健食品。