實時熒光定量PCR技術原理及在食品檢測中的應用

史曉霞

摘要：PCR技術主要工作是分析食品樣品中微生物的指令基因，從而辨別食品樣品當中微生物的種類及數量，以達到食品檢驗工作的目的。本文主要分析實時熒光定量PCR技術的技術原理及其在食品檢測中的具體應用，僅供參考。

關鍵詞：實時熒光定量PCR技術;食品檢測;應用

一、實時熒光定量PCR技術

1.傳統PCR技術

微生物檢測中的PCR技術就是聚合酶鏈式反應，又稱為無細胞分子克隆技術。在微生物檢測中應用PCR技術檢測食品安全，首先要搜集微生物中的細菌細胞，將細胞中的DNA進行分解，然后根據微生物中所持有的特點設計所需的引物，最后運用電泳法技術檢測細菌中DNA的排列順序。在微生物檢測中運用PCR技術檢測細菌具有靈敏度高及特異性強等優勢，可以快速檢測出食品中含有的細菌種類及狀態。

2.實時熒光定量PCR技術原理

實時熒光定量技術基礎在于：實時定量PCR技術與傳統PCR技術相比，基本原理相同，主要區別是其定量體系。將熒光染料或熒光基團加入到PCR反應體系中，使之具有特定波長。利用熒光信號，可對整個聚合酶反應過程進行實時自動檢測和監測。測量到的信號將被用來作為聚合酶鏈反應周期熒光閾值的坐標。

實時熒光定量PCR的定量方法中主要包括：（1）絕對的定量措施，通過構建合理的基因序列標準，并對其進行一系列的定量檢測工作，將標準品進行合理的稀釋工作之后，可以獲得多個不同稀釋之后的Ct數值。（2）相對定量：其主要是檢測人員不需要做一些額外的標準曲線，其具有簡便、省時等優勢。

檢測擴增產物時，若應用常規PCR技術只能檢測終點，實時熒光定量PCR技術是將熒光基團融入到PCR反應系統中，對熒光信號強度進行觀測從而觀察實驗全過程，其中指數增長階段數據分析最為適用，并且樣品DNA含量與Ct值（循環數）二者間的關系為線性，因此，樣品的定量分析可在完成標準曲線制定后開展。實時熒光定量PCR可分為SYBRGreenreal-timePCR和Taq[1]Manreal-timePCR。SYBRGreenreal-timePCR熒光染料可以實現以特異性方式插入DNA雙鏈中，并將熒光信號輸出，SYBR熒光染料未插入DNA雙鏈中則分子不會出現熒光，對于熒光信號觀察過程中通過熒光信號的強弱程度來確定PCR產物含量。DNA擴增后，該技術可以通過溶解曲線對單堿基突變進行檢驗。TaqManreal-timePCR熒光強度改變是通過熒光標記探針的熒光基團解離來實現的。在探針完整的情況下，猝滅基團可以將報告基團的熒光信號吸收;而擴增過程中，探針被酶切，2個基團分離，故產生熒光信號并被接收，最終通過熒光信號的強弱來觀測產物的形成。這樣的方式主要特點是模板與探針融合和水解使特異性更強，而且不需要進行電泳，簡化了流程，可實現單個反應將多種肉類同時進行鑒定的目的。

二、實時熒光定量PCR技術在食品檢測中的應用

1、動物源性檢測

以TaqManreal-timePCR為基礎，根據牦牛細胞色素B基因設計特異性引物和探針，并與其他動物物種的DNA進行擴增，結果表明，擴增曲線僅牦牛能夠形成，并且與其他物種DNA之間不存在交叉反應，靈敏度可達到0.001%，對牛肉的摻假檢測具有重要意義。李亮等[45]則利用牛線粒體和16SrDNA內參基因進行相應的試驗，并通過標準曲線計算出樣品中牛的DNA水平和總DNA水平，以此計算出回收率（平均回收率為98.62%）。由于線粒體DNA在不同組織中拷貝數不同，而細胞核DNA具有高度保守性和一致性，且在同一物種的不同細胞中拷貝數基本一致。所以目標基因的設立除了線粒體，還可以是核基因。此外，利用單拷貝核基因設計引物和探針并運用熒光定量PCR的方法進行了羊肉的摻假檢測，由于在之前的研究中發現，若僅應用標準曲線進行定量會存在一定的誤差，因此，該試驗中引入了1個常數（修正因子）將摻假肉中的DNA濃度轉化為目標肉類所占的比例，以此提高肉類摻假檢測的準確性。

2、食源性致病菌檢測

沙門氏菌是食物中最重要的食源性病原菌之一。數據顯示，沙門氏菌在我國及世界各地的食物中毒病原菌中占很大比例，對人類和動物造成極大傷害，導致食物中毒、傷害、腸胃炎等諸多疾病。通過對inva基因設計引物，用熒光染料法建立沙門氏菌RTQ-PCR檢測方法，結果顯示沙門氏菌檢測下線達到101cfu/ml，靈敏度高，可以快速、準確地檢測肉制品中的沙門氏菌，操作簡單，耗時短。采用實時熒光定量pcr方法對生豬肉、生雞肉、生菜沙拉和羊乳制品中沙門氏菌的檢測進行了比較。結果表明，該方法快速、有效、檢測范圍廣，符合國際標準，具有實用價值。

3、轉基因食品檢測

隨著大量轉基因食品進入市場，轉基因食品的標簽和安全性問題越來越受到人們的關注。傳統的檢測方法存在著靈敏度低、操作繁瑣、誤報率高等缺點。建立準確、快速、靈敏的鑒別方法已成為當今研究的熱點。實時熒光定量PCR技術作為一種新技術，在分子水平上檢測轉基因成分具有較高的準確性，因此廣泛應用于轉基因成分的定性、品種鑒定和含量檢測。利用轉基因小麥外源片段和染色體邊界序列設計引物，建立了實時熒光PCR檢測轉基因小麥b73-6-1、b72-8-11b和b102-1-2品系，同時以轉基因玉米、大豆、水稻和非轉基因小麥為對照，結果表面該方法特異性好，靈敏度可達0.01%（m/m），為檢測具有同樣外源基因的不同轉基因小麥品系提供了一種更高效的方法，具有很大的應用價值。

結語

本文主要從傳統PCR技術入手，重點分析了實時熒光定量PCR技術的應用原理，及其在食品檢測中的具體應用，包括在動物源性檢測、轉基因食品檢測以及食源性致病菌檢測中的應用，研究表明，實時熒光定量PCR技術在食品檢測中的應用優勢較為明顯，且滿足當代食品安全發展需要。

參考文獻

[1]高鑫，朱武洋，盧學新.實時熒光定量PCR在病毒檢測中的應用[J].中國人獸共患病學報，2018，34（07）：660-667.