放射性藥品的放化純度分析方法概述

張 云，楊 柳，姜 華

(原子高科股份有限公司，北京 102413)

放射性藥品是指用于臨床診斷或者治療的放射性核素制劑或者其標記化合物[1]。放化純度是評價放射性藥品質量的關鍵質控項目之一，任何放射性藥品均可能存在影響放化純度的放射性化學雜質，其主要來源是：(1) 制備過程的副反應或者中間體純化不完全；(2) 放射性核素與制劑中輔料成分的反應；(3) 儲存期間射線輻射引起活性成分分解、活性成分化學不穩定(水解、氧化-還原等)等。這些放射化學雜質可能會影響藥品在人體的生物分布，干擾診斷準確性或者引起治療照射不足，并對人體其他組織器官造成不必要的輻射損傷等。因而必須嚴格控制放化純度，保證藥品的安全性和有效性[2-3]。本文通過查閱《中國藥典》2020年版(ChP 2020)、《歐洲藥典》10.2版(EP 10.2)和《美國藥典》43-NF38版(USP 43-NF38)收錄有關放化純度測定的相關指導原則[1,4-5]、各國放射性藥品質量標準以及相關文獻資料，對放化純度測定常用分析方法的特點、分離原理和應用進行總結概述，為建立更科學、合理的放射性藥物質量標準提供參考。

1 指導原則及測定方法

《中國藥典》2020年版(ChP 2020)、《歐洲藥典》10.2版(EP 10.2)和《美國藥典》43-NF38版(USP 43-NF38)收錄的放射性檢定法相關指導原則對放化純度測定均作了規定，相關的指導原則以及測定方法比對列于表1。放化純度的測定過程一般分為兩個階段，首先通過分離技術將不同的化學物質進行分離，再用合適的放射性測量儀器測定每種化學物質的放射性活度。在ChP 2020通則1401放射性藥品檢定法中收錄的放射性化學測定方法主要包括薄層色譜法(thin-layer chromatography, TLC)、紙色譜法(paper chromatography, PC)和電泳法(electrophoresis, EP)，經這些方法分離后所獲得的薄層板/色層紙置于放射性薄層掃描儀或者γ計數器中測得放射性分布，從而得到放化純度；另外，也規定了經過驗證并且能有效分離各種放射化學雜質的其他分離分析方法，如高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)、柱色譜法(column chromatography, CC)等可用于放化純度測定，但ChP 2020收錄的各放射性藥品質量標準放化純度測定項下除薄層色譜法和紙色譜法以外未收錄其他方法。而EP 10.2和USP 43-NF38中相關通則的規定與品種標準相結合，除TLC、PC、EP這些常規方法之外，還收錄了液相色譜儀串聯紫外或電化學等常規檢測器與放射性流量檢測器測定放化純度的分析技術，即HPLC法。HPLC法適用于不同類型的樣品，分離效能、檢測靈敏度高，尤其是對于結構比較復雜的標記化合物，采用HPLC法或與其他方法聯合的分離檢測技術手段，可較全面地對放射性藥品的雜質譜進行分析與控制。

表1 ChP 2020、 EP 10.2 、 USP 43-NF38相關通則中放化純度測定方法比較Table 1 Comparison of radiochemistry purity measurement methods in the general monograph of ChP 2020, EP 10.2 and USP 43-NF38

2 主要分析方法

2.1 薄層色譜法

薄層色譜法又稱薄層層析法，是將固定相均勻地涂鋪在具有光潔表面的玻璃、塑料或金屬板上形成薄層，在此薄層上進行色譜分離的一種平面色譜方法[6]。薄層色譜法具有操作簡便、成本低、適用范圍廣等優點，但是對復雜樣品的分離效率以及鑒別能力有待提高。

其分離原理包括極性吸附和液-液分配。(1) 極性吸附，一般以吸附劑為固定相的薄層色譜法，指吸附劑對各組分具有不同的吸附能力，展開劑對吸附于其中各組分的溶解、解吸附能力不相同，組分在隨流動相遷移過程中不斷被吸附、解吸附、再吸附、再解吸；(2) 液-液分配，一般以液體為固定相的薄層色譜法，主要是利用各組分在固定相與流動相之間的分配系數不同，分配系數大的組分在板上的遷移速度慢，反之亦然，從而在薄層板上產生差速遷移而分離[6]。

按照固定相種類，薄層板可分為正相薄層板(硅膠薄層板、聚酰胺薄層板等)和反相薄層板(如C18鍵合相薄層板等)[7]。

2.1.1正相薄層色譜法 正相薄層板主要以硅膠為主，適用于大部分化學結構的分離。硅膠薄層板作為固定相，展開劑為單組分溶劑時，分離過程相對簡單。以锝[99mTc]雙半胱乙酯注射液為例，分子結構示于圖1。EP 10.2與USP 43-NF38收錄的放化純度檢查方法均采用快速硅膠板作為固定相和乙酸乙酯作為展開劑，屬于典型的正相薄層色譜法，通過吸附分離原理實現活性成分锝[99mTc]雙半胱乙酯與锝[99mTc]雙半胱乙酯的酯基水解物等六種雜質的分離[4-5]。

圖1 锝[99mTc]雙半胱乙酯的分子結構[5]Fig.1 The molecular structure of 99mTc-ECD[5]

以二元、三元甚至多元溶劑組成的展開劑體系占多數，在混合展開劑中占比較大的主要溶劑起調整改善分離物質的比移值(retardation factor,Rf)及對某些物質的選擇作用，一般主要溶劑選用不易形成氫鍵的溶劑，或極性比分離物質低的溶劑，否則將使被分離物質的Rf太大甚至跟隨溶劑前緣移動，不易將各組分分離[8]。值得注意的是，國內外藥典中收錄的多種锝標記藥物，如锝[99mTc]噴替酸鹽注射液、锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽注射液、锝[99mTc]焦磷酸鹽注射液、锝[99mTc]葡庚糖酸鹽注射液等，以快速硅膠板作為固定相，以水相和有機相作為雙體系展開劑，正是利用了活性成分在不同展開劑體系下吸附作用效果不同來實現主峰锝[99mTc]標記化合物與雜質膠體锝[99mTc]、高锝[99mTc]酸鹽的分離[4-5, 9]。

臨床應用于腎及泌尿系統功能檢查的鄰碘[131I]馬尿酸注射液，分子結構示于圖2，在EP 10.2收錄的質量標準放化純度測定項下采用GF254硅膠作為固定相，水-冰醋酸-丁醇-甲苯(體積比為1∶4∶20∶80)混合體系作為流動相，甲苯作為主要溶劑起著調整改善主峰鄰碘[131I]馬尿酸鹽與雜質峰碘[131I]離子、鄰碘[131I]苯甲酸的分離作用，對于各放射性成分的鑒別，采用了非放射性物質碘離子、鄰碘馬尿酸和鄰碘苯甲酸參照溶液在紫外波長254 nm下進行定位，并與放射性分布進行對比，得到碘離子、鄰碘馬尿酸和鄰碘苯甲酸的Rf分別位于薄層板的原點、中部和前沿，分離效果較好[4]。

圖2 鄰碘[131I]馬尿酸的分子結構[4]Fig.2 The molecular structure of sodium iodohippurate [131I][4]

以聚酰胺為載體的薄層板，由于聚酰胺分子內存在很多酰胺基，可與酚類、酸類、醌類及硝基化合物等形成氫鍵，因而對這些物質產生了吸附作用[8]。一般在水中形成氫鍵的能力最強，在有機溶劑中形成氫鍵的能力較弱，在堿性溶劑中形成氫鍵的能力最弱。ChP 2020锝[99mTc]甲氧異腈注射液和锝[99mTc]雙半胱乙酯注射液采用聚酰胺-6作為固定相。锝[99mTc]雙半胱乙酯注射液放化純度測定所用固定相和展開劑為聚酰胺-6薄片和甲醇-二氯甲烷-水(體積比為80∶15∶5)，在該展開體系下，主峰的Rf為0.9，雜質峰高锝[99mTc]酸鹽和膠體锝[99mTc]的Rf在原點附近[9]。

2.1.2反相薄層色譜法 反相薄層色譜法是以反相硅膠薄層板作為固定相的一種薄層色譜法，分離機制屬于分配色譜，色譜柱主要為C2、C8和C18等烷基鏈修飾的硅膠，可用于分析非極性化合物(類酯、芳香族化合物)和極性化合物(堿性和酸性化合物)[6]。

以氟[18F]多巴為例，作為L-多巴的類似物，結構示于圖3a，在臨床上是研究大腦突觸前多巴胺能神經功能的正電子顯像劑，可用于早期帕金森氏病的診斷[10]以及腫瘤的鑒別診斷研究[11]，《歐洲藥典》收錄其放化純度分析方法采用TLC十八烷基硅烷基手性硅膠板為固定相和甲醇-水(體積比為50∶50)為展開劑的反相薄層色譜法，從而有效地將活性成分左旋氟[18F]多巴和氟[18F]離子、活性成分的光學異構體右旋氟[18F]多巴(結構如圖3b所示)這兩個雜質峰進行分離，Rf值分別為0.3、0.5和0，并通過茚三酮與氨基酸或肽的特征反應對活性成分與其光學異構體進行區分鑒別。

圖3 左旋氟[18F]多巴(a)和右旋氟[18F]多巴(b)的分子結構[4]Fig.3 The molecular structure of L-[18F]Fluorodopa (a) and D-[18F]Fluorodopa (b)[4]

2.2 紙色譜法

紙色譜法是以紙為載體，以紙上所含水分或其他物質為固定相，用展開劑展開的分配色譜法[7]。主要分為正相紙色譜法和反相紙色譜法[6]。紙色譜法具有操作簡便、成本低等優點，對于復雜樣品的分離效率及鑒別能力有待提高。

其分離原理如下：紙的材質是纖維素，分子結構中含有許多羥基，有較強的親水性，通常能吸收約20%的水分，這些水作為分配色譜中的固定相，或低極性溶劑處理紙后作為固定相，當展開劑通過毛細作用在紙上滲透擴展的過程中，待分離物質因在固定相與展開劑中的分配系數不同而得到分離。

2.2.1正相紙色譜法 正相紙色譜法是指以紙為載體，以紙上所含水分作為固定相，用展開劑展開的分配色譜法。正相紙色譜法在放化純度測定中的應用比較廣泛。ChP 2020和USP 43-NF38收錄的用于甲狀腺疾病診斷或治療用碘[131I]、碘[123I]相關放射性藥品，包括碘[131I]/碘[123I]化鈉口服溶液、碘[131I]/碘[123I]化鈉膠囊，均采用紙色譜法進行放化純度測定，展開劑為甲醇的水溶液，放射性主峰碘[131I]/碘[123I]離子Rf約為0.8，可能存在的放射性雜質碘[131I]/碘[123I]酸根Rf約0.3，能夠實現主峰與雜質峰的有效分離[5,9]。為了降低或避免碘[131I]/碘[123I]與紙纖維的特異性吸附效應，在進行供試品溶液點樣前，先取一定量的載體溶液適量點于色層紙上，晾干后在同一位置進行供試品溶液的點樣。USP 43-NF38采用淀粉遇碘變藍的顯色原理對碘離子進行鑒別[9]。另外，ChP 2020收錄的來昔決南釤[153Sm]注射液、磷[32P]酸鈉鹽口服溶液、锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽注射液等也采用了正相紙色譜法測定放化純度。

將色層紙進行電解質溶液的預處理可以減少或消除吸附作用以提高分離效果，常用一定比例的甲醇-水或者丙酮-水、乙酸-水或乙腈-水、乙酸-乙腈-水、三氯甲烷-甲醇-水等極性大的混合溶劑體系作為展開劑。氟[18F]化鈉注射液是一種正電子藥物，主要用于活躍的成骨性反應骨疾病的診斷[12]。姜華等[13]開發了一種快速簡便的測定其放化純度的分析方法，即采用2%醋酸鈉溶液處理過的Whatman No.1色層紙作為固定相，50%甲醇水溶液作為展開劑。氟[18F]離子與穩定的氟離子化學性質相同，配制穩定的氟離子溶液用同樣的方法展開，淋洗后離子色譜分析得到的主峰位置與氟[18F]離子一致，從而實現對氟[18F]離子的鑒別。

2.2.2反相紙色譜法 以色層紙做支持體，采用低極性溶劑如烴類(石油醚、十一烷、硅油等)處理色層紙后作為固定相，再以極性大的溶劑作為展開劑時，則為反相分配紙色譜法。但目前ChP 2020、EP 10.2和USP 43-NF38均未收錄該分析方法，未來在新藥研發放射性藥品放化純度測定領域的應用還有待開發。

2.3 電泳法

電泳是指溶解或懸浮于電解液中帶電荷的蛋白質、膠體、大分子或其他粒子，在電場作用下向其自身所帶電荷相反的電極方向遷移。電泳法利用溶液中帶有不同量電荷的陽離子或陰離子，在外加電場中使供試品中各組分以不同的遷移速度向對應的電極移動，實現分離并通過適宜的檢測方法記錄或計算。該方法準確度高，與其他方法相比，適用范圍較窄、操作繁瑣。一般可分為兩大類：一類為自由溶液電泳或移動界面電泳，另一類為區帶電泳[1]。

電泳法應用于放射性藥品放化純度測定并不廣泛，只有《美國藥典》和《歐洲藥典》對于氯化鉈[201Tl]注射液采用了區帶電泳法。EP 10.2和USP 43-NF38采用醋酸纖維素薄膜作為支持介質，電解質溶液分別采用依地酸二鈉溶液和戊二酸鈉溶液。電泳完畢后，取出并干燥，使用合適的放射性檢測器確定放射性強度分布，該品種的主要雜質是鉈[201Tl](Ⅲ)離子，電泳法可有效將活性成分鉈[201Tl](Ⅰ)和鉈[201Tl](Ⅲ)離子分開[4-5]。

USP 43-NF38版收錄的鉻[51Cr]依地酸鈉鹽溶液也采用電泳法作為放化純度測定方法[5]。

2.4 高效液相色譜法

高效液相色譜法是在高壓下，利用不同組分與固定相和液體流動相作用力不同實現分離的色譜技術。HPLC系統包括高壓輸液泵、進樣器、色譜柱(柱溫箱)、檢測器和數據處理系統[6]。

HPLC法測定放化純度是在檢測器模塊處將放射性檢測器串聯于常規檢測器(如紫外分光光度計、二極管陣列檢測器、電化學檢測器等)之后，色譜系統前端色譜柱與流動相相互作用實現各種組分的分離，并流經放射性檢測器確定各組分的放射性分布，常規檢測器在放射化學測定中的用途是檢測“冷化合物”的色譜峰，并與各放射性化學成分進行比對從而實現鑒別。該方法具有準確度高、精密度好、組分之間分離效率高、適用范圍廣等優點，與其他方法相比，檢驗準備時間長、對試劑純度要求高。

液相色譜法的分類方式很多，按HPLC法的分離原理不同進行分類，包括分配色譜法、吸附色譜法、離子交換色譜法、分子排阻色譜法等[6]。

2.4.1分配色譜法 分配色譜(partition chromatography)是最常用的液相色譜法。其分離原理是利用被分離組分在固定相和流動相中的分配性能不同實現分離。固定相為載體表面的填料，流動相為不同極性溶劑。當固定相極性大于流動相極性時，稱正相色譜(normal phase high performance liquid chromatography, NP-HPLC)，常用硅膠或鍵合極性基團的硅膠填充成的色譜柱。當固定相極性小于流動相極性時，稱反相色譜(reverse phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)。色譜柱多以鍵合非極性基團的載體為填充劑填充而成。常用的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基硅烷鍵合硅膠等。RP-HPLC比NP-HPLC在放射性藥品放化純度測定中的應用更廣泛。

177Lu-DOTATATE(標記前體分子結構示于圖4)作為FDA批準的第一款多肽受體靶向放射性核素治療(peptide receptor-radionuclide therapy, PRRT)藥物[13-14]，可作為患有轉移性或無法手術的胃腸胰神經內分泌瘤(gastro-entero-pancreatic neuroendocrine tumors, GEP-NETs)患者的一線治療方法[15-17]。Breeman等[18-19]報道了以C18 Symmetry色譜柱為固定相，二元溶劑體系(A=0.1%TFA水溶液，B=100%甲醇)作為流動相的RP-HPLC法。洗脫方式采用梯度洗脫，洗脫過程中能夠實現在較短時間內將干擾分離的強保留雜質組分從色譜柱中清除，使色譜柱保持干凈狀態，以進行下一次的分析；此外，梯度洗脫具有可提高峰分離度和增加峰容量的優點[20]。

圖4 DOTATATE的分子結構[18]Fig.4 The molecular structure of DOTATATE[18]

68Ga-DOTATATE可用于診斷神經內分泌腫瘤[21]，Mu等[22]對比了測定68Ga-DOTATATE放化純度的三種方法，發現采用RP-HPLC法進行梯度淋洗主峰與雜質峰分離度最好。

另外，EP 10.2收錄的鈷[57Co]標記的氰鈷[57Co]胺膠囊/氰鈷[57Co]胺溶液、鈷[58Co]標記的氰鈷[58Co]胺膠囊/氰鈷[58Co]胺溶液、碘[131I]化鈉治療/診斷膠囊/口服溶液、[11C]雷氯必利等品種，以及USP 43-NF38收錄的銦[111In]噴曲肽注射液等品種均采用RP-HPLC法作為放化純度測定方法。

2.4.2吸附色譜法 吸附色譜法是利用被分離組分對固定相表面吸附中心吸附能力的差別進行分離。其固定相為吸附劑，流動相為不同極性溶劑，利用不同組分與固定相吸附力的不同，以及流動相對不同組分解吸附力的不同實現分離。吸附色譜屬于NP-HPLC。吸附劑為多孔極性填料，常用硅膠；流動相為不同極性溶劑，常用二氯甲烷、正己烷、正丁醇、四氫呋喃等。

碘[131I]/碘[123I]芐胍注射液作為單光子顯像劑(以碘[131I]芐胍注射液為例，分子結構示于圖5)，在診斷神經脊的腫瘤如嗜鉻細胞瘤和神經母細胞等疾病方面具有較高的靈敏度和特異性。EP 10.2采用NP-HPLC分析方法，參數包括色譜用硅膠作為色譜柱的填料，80 g/L硝酸銨-稀氨水-甲醇(體積比為1∶2∶27)作為流動相，分光光度計(波長254 nm)與放射性檢測器聯用對主峰碘[131I]芐胍與雜質峰碘[131I]離子以及其他放射性雜質峰定性定量分析[4]。

圖5 碘[131I]芐胍的分子結構[4]Fig.5 The molecular structure of iobenguane[131I] sulfate[4]

2.4.3離子交換色譜法 離子交換色譜法(ion exchange chromatography, IEC)是利用被分離組分離子交換能力的差別實現分離，采用高壓輸液泵系統將規定的洗脫液泵入裝有填充劑的色譜柱對可解離物質進行分離測定。色譜柱用離子交換填充劑填充，有陽離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。

在USP 43-NF38和EP 10.2對氟[18F]化鈉注射液放化純度的測定均采用離子交換色譜法，色譜柱類型不同，其中《美國藥典》中L31類型色譜柱是指季胺基改性孔徑2 000 ?的交聯苯乙烯和二乙烯基苯(55%)強陰離子交換樹脂；另外采用的常規檢測器類型也不同，USP 43-NF38采用電導檢測器，EP 10.2則采用紫外檢測器；流動相分別使用強酸和強堿的溶液，對色譜系統不友好，參考歐美建立標準時應慎重考慮流動相的選擇。

除此以外，EP 10.2收錄的氮[13N]氨水采用陽離子交換色譜法測定放化純度，醋酸鈉碳[11C]注射液采用強堿性陰離子交換法測定放化純度。

2.4.4分子排阻色譜法 分子排阻色譜法(size exclusion chromatography, SEC)又稱體積排阻色譜法，色譜柱多以親水硅膠、凝膠或經修飾凝膠等為填充劑，因填充劑表面分布不同尺寸的孔徑，樣品中待分離組分進入色譜柱后，按其分子線團尺寸的差異實現分離。

《歐洲藥典》收錄的碘[125I]人血清白蛋白注射液放化純度測定采用分子排阻色譜法。以尺寸排阻色譜用硅膠為色譜柱固定相，磷酸氫二鉀-磷酸氫二鈉-氯化鈉混合溶液作為流動相，分光光度計(波長280 nm)與放射性檢測器聯用，并以人白蛋白溶液或其他適當的人白蛋白標準品經稀釋后作為參考溶液實現對活性成分鑒別，確定放射性主峰。

2.5 多種方法聯用

對于放射性化學雜質比較復雜的品種，采用單一的方法很難實現對所有雜質分離并鑒別，因此需要結合各種方法的優勢制定合理的雜質分析策略。

氟[18F]脫氧葡糖注射液采用硅膠薄層色譜法對主峰2-氟[18F]-2-脫氧-D-葡萄糖與氟[18F]離子、2-[18F]氟-2-脫氧-D-葡萄糖的部分或完全乙酰化的衍生物的極性差異進行分離，而采用離子交換色譜法對雜質2-[18F]氟-2-脫氧-D-甘露糖進行測定，兩種方法聯用可對活性成分和雜質進行定性鑒別。

放射性核素標記的多肽類藥物已越來越多應用于腫瘤、感染、血栓等的診斷和治療，以68Ga-DOTATOC注射液為例，其活性成分是68Ga標記的多肽絡合物，結構較為復雜，具體分子結構示于圖6，其在臨床上主要作為診斷神經內分泌腫瘤的新型藥物。對其放化純度測定采用快速硅膠薄層法分析雜質膠體鎵[68Ga]，采用液相色譜法對鎵[68Ga](Ⅲ)離子以及其他可能存在的雜質進行分析[4]。

圖6 68Ga-DOTATOC的分子結構[4]Fig.6 The molecular structure of 68Ga-DOTATOC[4]

多種方法聯用可以針對不同的雜質采用更適宜的方法，對雜質檢測的靈活性更強，適用范圍更廣。EP 10.2收錄其他品種也采用了多種方法聯用的分離技術，包括(1)18F-Alovudine注射液：正相薄層色譜法-反相液相色譜法(梯度洗脫)；(2)18F-Fluromisinidazole注射液：正相薄層色譜法-反相液相色譜法；(3) L-Methionine([11C]methyl)注射液：反相薄層色譜法-反相液相色譜法；(4) 锝[99mTc]人白蛋白注射液：正相薄層色譜法-尺寸排阻液相色譜法；(5) 锝[99mTc]巰替肽注射液：正相紙色譜法-反相液相色譜法；(6) 锝[99mTc]甲氧異腈注射液：反相薄層色譜法-正相紙色譜法-反相高效液相色譜法等。

四種分析方法的優缺點比對列于表2。薄層色譜法和高效液相色譜法的適用范圍最廣泛，電泳法可準確地分離不同電荷的陽離子或陰離子。

表2 四種分析方法優缺點比對Table 2 Comparison of advantages and disadvantages of four analysis methods

3 總結與展望

本文較為全面地概述了國內外藥典(ChP 2020、EP 10.2和USP 43-NF38)以及相關文獻資料有關放化純度測定的四種經典分析方法的特點、分離原理，并列舉了應用實例。在放化純度方法建立過程中，無論采用哪一種分析方法，需要重點關注放射化學雜質的研究。長遠來看，HPLC法或與多種方法聯用的分析方法將成為全面研究放射化學雜質的主流技術手段。液相色譜儀可與多種常規檢測器聯用，在執行的ChP 2020通則0512液相色譜法中增加了電噴霧式檢測器相關內容，對拓寬HPLC法在放化純度測定中的應用提供了更多選擇。國內核醫學正處于快速發展時期，放射性藥品作為核醫學的精神食糧，未來將會有更多新藥或者仿制藥開發工作的開展，如生長抑素類化合物等生物活性分子作為放射性藥品的標記前體，分子結構的特殊性對放射性化學雜質研究增加了難度，尤其是在對標記后主成分與其他雜質成分的鑒別上，液相色譜儀-高分辨質譜儀聯用將發揮重要的作用。