冷柱頭氣相色譜法測定示蹤劑[18F]PBR06注射液中有機溶劑含量

喬洪文，盛靈慧，梁志剛,3

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100053;2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100053;3.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 信息中心，北京 100053)

正電子發(fā)射斷層顯像(positron emission computed tomography, PET)能夠在體定量反應(yīng)特定靶向的功能情況，已經(jīng)成為臨床實用的分子影像手段，在疾病的研究、診斷、監(jiān)測和療效評價中發(fā)揮日益重要的應(yīng)用價值[1-2]。性質(zhì)優(yōu)良的示蹤劑是獲取良好PET圖像的必要條件，臨床上經(jīng)常采用的放射性核素包括：11C、18F、13N、68Ga等。PET顯像示蹤劑存在放射性半衰期的物理限制，需要制備后盡快使用，因此要求產(chǎn)品的質(zhì)控檢驗方法快速、有效；同時由于放射性可能會引起輻射損傷，要求質(zhì)控檢驗方法操作簡單、樣品量少[3]。對于新開發(fā)的正電子類示蹤劑，應(yīng)根據(jù)《正電子類放射性藥品質(zhì)量控制指導(dǎo)原則》[4]，制定適用的質(zhì)量標準，并通過臨床前研究驗證制備工藝和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性，以保證后續(xù)研究中示蹤劑制劑的安全性和研究的有效性。

[18F]PBR06是一種新型PET示蹤劑，主要用于檢測腦中神經(jīng)炎癥的分布和輕重程度。由于神經(jīng)炎癥表現(xiàn)在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均有重要作用，包括多發(fā)性硬化、腦腫瘤和神經(jīng)退行性疾病等，因此，[18F]PBR06具有重要的臨床和研究應(yīng)用價值[5]。[18F]PBR06注射液的制劑形式是含有10%(v·v-1)乙醇的0.5%(g·g-1)抗壞血酸鈉生理鹽水溶液，其中乙醇為助溶劑，用于維持[18F]PBR06在制劑中的溶解度、保持制劑穩(wěn)定，制劑中乙醇含量的合格范圍為8.0%～12.0%。[18F]PBR06注射液在生產(chǎn)過程中還使用了另外兩種有機溶劑：乙腈用于原料18F-脫水干燥和粗產(chǎn)物色譜純化，DMSO用作氟化反應(yīng)溶劑[6-7]?！吨袊幍洹?020年版中規(guī)定，產(chǎn)品制劑中乙腈的限量為0.041%，DMSO為0.5%[8]。正電子放射性藥物中的殘留溶劑通過氣相色譜測定，常用分流/不分流進樣口直接進樣法和頂空進樣法[10-14]，用于[18F]PBR06注射液分析存在的問題是：分流/不分流進樣口直接進樣法難以在一次進樣中準確測定低沸點溶劑乙醇、乙腈和高沸點溶劑DMSO的含量，而且[18F]PBR06制劑中乙醇含量較高，超出定量檢測線性范圍；頂空進樣法所需樣品量較多、耗時較長。本研究擬開發(fā)一種快速、樣品量少、能夠在一次進樣中快速完成定量檢測[18F]PBR06注射液中乙醇含量，以及乙腈、DMSO殘留量的制劑質(zhì)檢方法。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

色譜儀：安捷倫7890B氣相色譜儀，配備冷柱頭進樣口、G4513A型自動進樣器和FID檢測器；AB204E型電子天平：梅特勒公司。

1.2 主要試劑

乙醇：藥用級，南京化學(xué)試劑有限公司，批號：190509120B，含量99.93%；抗壞血酸鈉：藥用級，石藥集團，批號：219014801；乙腈(批號：STBH5417，含量99.96%)、DMSO(批號：STBH9550，含量99.99%)：分析純，Sigma；水：色譜級，F(xiàn)isher Chemical，批號：178475；生理鹽水：藥用級，中國大冢制藥有限公司，批號：9F99B1；[18F]PBR06注射液(批號：PBR06-20190808-XWH，PBR06-20191216～20191220-XWH 共6批次)：于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科放射性藥物實驗室制備。

1.3 色譜條件

采用Restek公司Stabilwax色譜柱(30 m×0.52 mm，1 μm)，載氣為高純氮氣。初始溫度為55 ℃，保持4 min，以40 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持3 min。檢測氣為氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度為240 ℃。冷柱頭進樣口溫度跟隨柱溫，進樣口恒定壓力5.5 psi(37.9 kPa)，進樣體積1 μL。

1.4 溶液配制

供試品溶液：[18F]PBR06注射液，基質(zhì)為含10%(v·v-1)乙醇的0.5%(g·g-1)抗壞血酸鈉-生理鹽水溶液。

空白溶液：精密稱取抗壞血酸鈉500 mg，溶解于100 mL生理鹽水，制得空白溶液。

標準溶液：在50 mL容量瓶中加入約40 mL空白溶液，用移液器向容量瓶中依次加入6 mL乙醇，32 μL乙腈、273 μL DMSO，稱量并記錄加入的準確質(zhì)量，然后用空白溶液定容，制得乙醇濃度為12%(v·v-1)、乙腈濃度為0.048%(g·g-1)、DMSO濃度為0.59%(g·g-1)的1號標準溶液。用空白溶液逐級稀釋1號標準溶液，制得2～6號標準溶液，乙醇濃度(v·v-1)依次為10%、5%、2%、1%、0.5%；乙腈濃度(g·g-1)依次為0.040%、0.020%、0.008 0%、0.004 0%、0.002 0%；DMSO濃度(g·g-1)依次為0.49%、0.25%、0.098%、0.049%、0.025%。

1.5 方法學(xué)驗證

1.5.1專屬性及系統(tǒng)適用性檢查 取空白溶液和2號標準溶液各100 μL，分別置于5 mL容量瓶中，用水定容并混勻，然后取1 mL置于樣品瓶中，按1.3節(jié)色譜條件進行分析，其中2號標準溶液連續(xù)進樣3次。

1.5.2精密度考察 取2號標準溶液100 μL，置于5 mL容量瓶中，用水定容并混勻，取樣并于同一日內(nèi)重復(fù)測定6次，考察各峰的保留時間和峰面積的相對標準偏差(RSD%)。

1.5.3線性范圍考察 取1～6號標準溶液各100 μL，分別置于5 mL容量瓶中，用水定容并混勻，然后各取1 mL置于樣品瓶中，每個樣品平行測定3次。分別以乙醇、乙腈和DMSO的峰面積為縱坐標，以1～6號標準溶液濃度為橫坐標進行線性回歸，考察各溶劑的線性范圍和決定系數(shù)R2。

1.5.4定量限和檢測限測定 采用線性范圍考察2號標準溶液的分析結(jié)果，按照信噪比10∶1和3∶1分別計算乙醇、乙腈和DMSO的定量限和檢測限，然后按照倍數(shù)將2號標準溶液用空白溶液逐級稀釋，制得乙醇、乙腈、DMSO的定量限和檢測限檢查溶液。分別移取100 μL上述檢查溶液，用5 mL水稀釋后按1.3節(jié)色譜條件進行分析(n=3)，分別考察乙醇、乙腈和DMSO的定量限和檢測限。

1.5.5加標回收率實驗 準確移取已測得各組分含量的[18F]PBR06注射液(批號為PBR06-20190808-XWH)5 mL，置于10 mL容量瓶中，分別加入高、中、低量的乙醇、乙腈和DMSO，然后用空白溶液定容，制得加標回收率檢查溶液。分別取上述回收率檢查溶液100 μL，置于5 mL容量瓶中，用水定容混勻，然后取1 mL置于樣品瓶中，照1.3節(jié)的色譜條件測試，每個樣品平行測定3次。

1.5.6系統(tǒng)耐用性初步分析 首先將樣口壓力分別設(shè)置為5.3 psi(36.5 kPa)、5.5 psi(37.9 kPa)和5.7 pis(39.3 kPa)，保持其余色譜條件如1.3節(jié)不變，取2號標準溶液稀釋液進樣分析；然后將樣口溫度分別設(shè)定為53 ℃、55 ℃和57 ℃，保持其余色譜條件如1.3節(jié)不變，取2號標準溶液稀釋液進樣分析。計算改變進樣口壓力和溫度時，乙醇、乙腈和DMSO保留時間和峰面積的相對標準偏差。

1.6 樣品測定

在[18F]PBR06注射液生產(chǎn)結(jié)束后(共5批次，批號：PBR06-20191216～20191220-XWH)，于鉛玻璃后取產(chǎn)品制劑100 μL，加入到5 mL容量瓶，采用水定容并搖勻，然后移取0.2 mL到微量GC樣品瓶中，按照1.3節(jié)的色譜條件進行分析，通過峰面積計算制劑中乙醇、乙腈和DMSO的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗證

2.1.1專屬性及系統(tǒng)適用性檢查 2號標準溶液分析結(jié)果表明，乙醇、乙腈和DMSO能夠獲得較好分離，保留時間依次為2.053 min、2.943 min和7.975 min，三個色譜峰之間的分離度大于1.5。乙醇、乙腈和DMSO的理論塔板數(shù)分別為1 199、9 697和615 360，拖尾因子分別為2.63、1.65和1.10。空白溶液分析結(jié)果中無可見色譜峰，對被測各組分無干擾，色譜圖見圖1。2號標準溶液3次連續(xù)進樣中乙醇保留時間和峰面積的相對標準偏差分別為0.5%和0.1%，乙腈為0.1%和1.8%，DMSO為0.0%和2.4%。以上結(jié)果表明，本研究開發(fā)的GC條件具有較好的專屬性和系統(tǒng)適用性[9]。

圖1 空白溶液(a)和2號工作標準溶液(b)的氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram of blank (a) and No.2 standard (b)

2.1.2精密度 方法精密度考察結(jié)果見表1，乙醇、乙腈和DMSO三種目標物的保留時間和峰面積的相對標準偏差均小于5%，表明本色譜方法精密度良好，符合《中國藥典》2020版中關(guān)于殘留溶劑重復(fù)性的要求(RSD≤5%)[7]。

表1 GC方法精密度測試結(jié)果Table 1 The results of precision inspection for the GC method validation

2.1.3線性范圍 根據(jù)1～6號標準溶液分析結(jié)果得到回歸方程列于表2，乙醇、乙腈和DMSO分別在0.5%～12.0%(v·v-1)，0.004 0%～0.048 0%(g·g-1)和0.025%～0.590%(g·g-1)濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。[18F]PBR06注射液中乙醇含量的理論值為10%(v·v-1)，合格范圍為8.0%～12.0%(v·v-1)；殘留溶劑乙腈限度為0.041%，DMSO為0.50%。本研究GC方法的線性范圍涵蓋以上三種溶劑的檢測限度。

表2 方法線性范圍考察結(jié)果Table 2 The results of linear range inspection

2.1.4定量限(S/N=0)和檢測限(S/N=3)測定 將2號標準溶液經(jīng)系列稀釋后分析，測得乙醇的定量限為0.15%(v·v-1)，檢測限為0.05%(v·v-1)；乙腈定量限為0.002 9%(g·g-1)，檢測限為0.000 87%(g·g-1)；DMSO定量限為0.008 2%(g·g-1)，檢測限為0.002 5%(g·g-1)。

2.1.5加標回收率 高、中、低濃度的加標回收率檢查溶液中的溶劑濃度為限度120%、100%和80%，分析結(jié)果列于表3，三種待測溶劑的加標回收率均大于95%，表明該方法具有良好的準確度。

表3 方法加標回收率考察結(jié)果Table 3 The results of standard addition recovery inspection

2.1.6系統(tǒng)耐用性 在色譜柱選擇上，Stabilwax色譜柱適用于高含水量和高鹽樣本分析，研究結(jié)果表明此款色譜柱可以實現(xiàn)制劑中各目標組分的良好分離，同時具有良好的重現(xiàn)性和精密度。樣口壓力分別設(shè)置為5.3 psi(36.5 kPa)、5.5 psi(37.9 kPa)和5.7 pis(39.3 kPa)，取2號標準溶液分析，結(jié)果表明，三種目標物的保留時間相對標準偏差<0.94%，峰面積<1.83%。進樣口初始溫度分別設(shè)置為53 ℃、55 ℃和57 ℃，2號標準溶液中三種目標物的保留時間相對標準偏差<0.68%，峰面積<1.57%。以上數(shù)據(jù)表明該方法耐用性良好。

2.2 樣品測定

5批次[18F]PBR06注射液分析結(jié)果列于表4，乙醇含量和乙腈、DMSO殘留量均合格。在生產(chǎn)過程中，乙醇主要作用是將純化后產(chǎn)品從固相萃取小柱上洗脫，加入到抗壞血酸鈉生理鹽水溶液中，并使產(chǎn)品穩(wěn)定溶解于制劑溶液中。生產(chǎn)中投入乙醇的量為最終產(chǎn)品制劑的10%(v·v-1)，但是由于乙醇和生理鹽水溶液在生產(chǎn)體系中有不同程度的殘留，導(dǎo)致實際進入最終產(chǎn)品制劑中的乙醇比例發(fā)生變化，產(chǎn)品制劑中乙醇含量的合格范圍為8.0%～12.0%(v·v-1)。檢驗批次產(chǎn)品中乙醇含量均合格。

表4 5批[18F]PBR06注射液質(zhì)控分析結(jié)果Table 4 The results of quality control tests of five batchs

[18F]PBR06注射液生產(chǎn)過程，乙腈用于原料F-18離子的除水劑和制備色譜的流動相；DMSO用作氟化反應(yīng)溶劑?！吨袊幍洹?020版中規(guī)定，產(chǎn)品制劑中乙腈和DMSO的限度分別為0.041%和0.5%[8]。經(jīng)檢驗的5批產(chǎn)品中的乙腈和DMSO殘留量均合格。

3 討論

正電子核素標記的PET示蹤劑具有放射性和較短的物理半衰期，這要求藥物制劑的質(zhì)控檢驗方法快速、測試樣品量小[12-14]。常用的藥物制劑中有機溶劑的檢查方法為頂空進樣法和分流/不分流進樣口直接進樣法。頂空進樣法是指將供試品溶液置于密閉小瓶中，在恒溫控制的加熱室中加熱至供試品中揮發(fā)性組分在液態(tài)和氣態(tài)達到平衡后，由進樣器吸取一定體積的頂空氣注入色譜柱中進行分析。頂空進樣法可用于極性差異較大的多組分分析，缺點是需要較長的平衡時間和較多樣品量。分流/不分流進樣口直接進樣法是指將供試品溶液直接注入進樣口中，溶液在進樣口氣化室中完成氣化，然后部分或全部進入色譜中進行分離測定。該方法的優(yōu)點是所需樣品量少、速度較快，缺點是可能存在高沸點組分氣化不完全、樣品加熱氣化過程中發(fā)生改變等問題，導(dǎo)致進樣口易被污染、對高沸點組分檢測的重復(fù)性較差。

冷柱頭進樣口直接進樣法是將供試品溶液直接注射到色譜柱中，在色譜柱中完成氣化和分離的氣相分析技術(shù)。該技術(shù)不存在進柱前加熱汽化過程，避免了樣品組分岐視效應(yīng)、進樣針頭選擇性蒸發(fā)和非線性分流等問題，具有良好的穩(wěn)定性和檢測靈敏度。該技術(shù)的缺點是進樣口結(jié)構(gòu)復(fù)雜，襯管和進樣器針頭需要對應(yīng)色譜柱直徑；非揮發(fā)性組分可能沉積在色譜柱柱頭，造成污染。冷柱頭進樣口直接進樣法在國內(nèi)外的研究中主要用于熱不穩(wěn)定樣品或痕量組分的分析，在食品、農(nóng)藥和石油工業(yè)中應(yīng)用較多[15-18]；用于藥物檢驗的報道較少，這主要是由于常規(guī)藥物批量較大，對取樣量和檢測時間的限制較小，采用應(yīng)用較廣泛的分流/不分流進樣口即可滿足檢測要求；冷柱頭進樣口用于放射性藥物質(zhì)控檢測此前尚未見文獻報道。放射性藥物生產(chǎn)具有批量小、質(zhì)控樣品量較少的特點，冷柱頭進樣口直接進樣法所需樣品量少，通過數(shù)微升樣品即可完成檢測，而且檢測時間短，可通過一次進樣測定制劑中乙醇和殘留溶劑含量；此外放射性藥物中有效物質(zhì)含量低，可以避免冷柱頭進樣口因非揮發(fā)性組分沉積而造成污染。采用冷柱頭進樣口直接進樣法進行放射性藥物制劑中有機溶劑分析，可充分發(fā)揮該方法快速、樣品少、定量范圍寬等優(yōu)點，而避免柱頭污染等弊端，具有良好的應(yīng)用價值。

本研究采用冷柱頭進樣口直接進樣法測定[18F]PBR06注射液中有機溶劑含量，方法學(xué)驗證結(jié)果表明，該方法用于乙醇定量檢查和乙腈、DMSO限度檢查符合《中國藥典》要求。該方法可在一次進樣中完成三種待測溶劑的檢測，運行時間小于12 min，而且使用的樣品量相當(dāng)于4 μL產(chǎn)品制劑原液，可大幅減低暴露在環(huán)境中的放射性活度，減少操作人員受到的輻射劑量。本研究證明冷柱頭進樣口直接進樣方法適用于[18F]PBR06產(chǎn)品制劑的質(zhì)控檢查，有利于保證藥物制劑的安全性，對[18F]PBR06的推廣應(yīng)用具有重要意義。此外，本研究開發(fā)方法還適用于其他制劑中乙醇含量為0.5%～12%(v·v-1)的放射性藥物的質(zhì)控分析，在本實驗室已經(jīng)用于β淀粉樣蛋白示蹤劑[18F]AV-45、Ⅱ型囊泡單胺轉(zhuǎn)運體示蹤劑[18F]FP-DTBZ和多巴胺D2受體示蹤劑[18F]Fallypride的殘留溶劑質(zhì)控檢測。

4 結(jié)論

冷柱頭直接進樣氣相色譜法適用于放射性藥物制劑[18F]PBR06注射液中的乙醇含量測定和乙腈、DMSO殘留量檢查，具有快速、樣本量小的優(yōu)點，可通過單次進樣即獲得三種待測溶劑含量，有利于提高藥物質(zhì)控分析效率，并且該方法可進一步用于其他制劑組成類似的放射性藥物的質(zhì)控分析。