芪紅通絡顆粒對大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用及其機制研究

高玉菊，楊滿琴，王 麗，羅勝勇

(1.安徽中醫藥大學第二附屬醫院，安徽 合肥 230061；2.安徽省醫學科學研究院，安徽 合肥 230061)

缺血性腦卒中是臨床常見疾病，重度致殘者約占40%，是目前威脅人類健康的三大疾病之一。靜脈性藥物溶栓治療是目前缺血性腦血管病治療的有效措施，但是治療時間窗狹窄(發病4.5 h以內)，還可能增加腦內出血轉化風險，因而限制了其使用。更為關鍵的是，缺血區血液恢復灌通后又可能進一步加重腦功能障礙，產生腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)。目前，針對CIRI尚無理想的干預措施，因此，充分研究其發生機制，尋求有效的治療藥物對于改善缺血性腦卒中預后具有重要意義。研究表明，氧化應激中產生的活性氧在CIRI的發病過程中起著至關重要的作用。芪紅通絡顆粒是以活血化瘀、益氣化痰為基本治療大法嚴謹選藥的臨床經驗方，由紅花、黃芪、全蝎、蜈蚣、當歸、菊花、雞血藤、水蛭、僵蠶、白附子共10味中藥組成。現代藥理學研究提示，紅花有保護神經細胞的作用，黃芪能夠有效改善抗氧化酶活性，提高神經細胞的抗損傷能力，當歸有抗炎、抗氧化的作用。本研究擬通過建立局灶性大鼠CIRI模型，探討芪紅通絡顆粒對CIRI的保護作用及其可能的作用機制，以期為芪紅通絡顆粒治療缺血性腦卒中提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠，體質量250～300 g，由安徽醫科大學實驗動物中心[動物生產許可證號：SCXK(皖)2017-001；動物使用許可證號：SYXK(皖)2019-008]提供。動物購買后適應性飼養1周進行實驗。實驗室條件：溫度18～26 ℃，濕度40%～70%。

1.2 藥品與試劑 芪紅通絡顆粒(批號20181223，每袋10 g)：安徽中醫藥大學第二附屬醫院藥劑科研制；尼莫地平片(批號20190219，每片20 mg)：山東健康藥業有限公司生產；丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(批號20190622)、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(批號20190626)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒(批號20190916)：南京建成生物工程研究所；2,3,5-氯化三苯四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)：美國Sigma公司；水合氯醛(批號T20170321)：國藥集團化學試劑有限公司；兔抗核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)多克隆抗體：美國Cell Signaling Technology。

1.3 儀器 FSH-2可調高速勻漿機：金壇市金南儀器制造有限公司；TGL18W高速臺式冷凍離心機：長沙英泰儀器有限公司；MODEL 550酶標儀：美國BIO-RAD公司；BIO-RAD凝膠成像系統：美國伯樂公司；Axioscope A1病理成像系統：德國蔡司公司；UV-240紫外分光光度計：日本島津公司。

2 方法

2.1 分組及給藥 取180只雄性SD大鼠隨機分為6組：假手術組，模型組，尼莫地平組(10 mg/kg)，芪紅通絡顆粒高劑量(10.8 g/kg)、中劑量(5.4 g/kg)、低劑量(2.7 g/kg)組，每組30只。各組模型復制前灌胃給予相應藥物3 d，模型復制后給藥2 d，每日1次，模型復制后3 d處死大鼠取材。假手術組及模型組給予等容積生理鹽水。

2.2 CIRI模型制作 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后仰臥位固定于手術臺上。暴露右側頸總動脈，游離分出頸內動脈及頸外動脈。頸外動脈距離頸總動脈分叉部1 cm處結扎并剪斷，動脈夾夾閉頸總動脈和頸內動脈，于頸外動脈和頸總動脈分叉部0.5 cm處剪開一小切口。用0.24 mm直徑的線栓經切口插入頸內動脈，在頸總動脈分叉處前進18～20 mm有輕微阻力感時停止。準確記錄此刻時間，栓塞2 h后緩慢撤出線栓，實現再灌注。大鼠蘇醒后，手術對側肢體出現運動障礙作為模型制備成功的判斷標準。實驗過程中嚴格控制室溫為23～25 ℃，大鼠肛溫維持37 ℃左右。假手術組只分離血管，不插入線栓。剔除死亡及出血過多的動物，每組不少于24只大鼠。

2.3 大鼠神經功能缺陷評分 再灌注72 h后每組隨機取8只動物，參照Longa五級評分法進行神經功能缺陷評分。0分：無神經功能缺陷癥狀；1分：不能完全伸展手術對側前爪；2分：行走時出現向手術對側轉圈；3分：行走時身體向手術對側傾倒；4分：不能自發行走，意識喪失。

2.4 腦梗死體積測定 神經功能評分結束后處死大鼠，取出腦組織，去除嗅球、小腦和腦干，生理鹽水沖洗腦組織表面血污，吸干，-20 ℃冷凍10 min使其變硬，沿冠狀面切成1.5 mm 厚的腦片，37 ℃條件下置于2% TTC染液中染色30 min，取出腦片于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。最后將每只大鼠腦片整齊排列，拍照保存，紅色為正常區，白色為缺血梗死區。采用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0測定每張腦片腦梗死體積及占對側腦體積的百分比。

2.5 腦組織SOD、GSH-Px和MDA含量測定 從每組剩余大鼠中隨機取8只，麻醉處死后取出腦組織，稱質量后加入生理鹽水，用組織勻漿機制成10%的組織勻漿，離心后取上清液，用生化試劑盒測定SOD、GSH-Px和MDA的含量。

2.6 腦組織病理學檢查 從每組剩余的8只大鼠中隨機取4只，斷頭處死后取出缺血側腦組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后行冠狀切片。蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin， HE)染色后脫水封片，光學顯微鏡下觀察缺血側腦組織病理變化。

2.7 Western blot法測定腦組織中Nrf2和HO-1蛋白表達水平 將剩余4只大鼠麻醉后處死，斷頭，取損傷側皮質，-80 ℃冰箱中凍存，備用。臨用時，取出皮質，加入1 mL冰冷細胞裂解液后用組織勻漿器勻漿3 min，冰浴30 min，隨后在4 ℃條件下離心(4 000 r/min)10 min，按文獻[9]方法提取總蛋白和核蛋白，取上清液，采用BCA法測定蛋白含量。各組取25 μg總蛋白和25 μg核蛋白進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后將蛋白由凝膠轉印到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉2 h后加入相應的一抗(Nrf2、HO-1)稀釋液，4 ℃孵育過夜。次日用TBST緩沖液洗膜3次(每次10 min)，加入二抗孵育1 h，顯影后用凝膠成像系統掃描測定。以目標蛋白條帶與β-actin條帶灰度值比值作為該蛋白相對表達水平。

3 結果

3.1 芪紅通絡顆粒對大鼠神經功能評分的影響 結果顯示，假手術組大鼠未出現明顯神經功能缺損；與假手術組比較，模型組大鼠表現出明顯的行為學障礙，神經功能評分較高；與模型組比較，芪紅通絡顆粒高、中劑量組神經行為學障礙癥狀明顯減輕，差異有統計學意義(

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05)。見表1。

表1 芪紅通絡顆粒對大鼠CIRI后神經功能缺損評分的影響

3.2 芪紅通絡顆粒對大鼠腦梗死體積的影響 結果顯示，假手術組未出現腦缺血情況；與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死體積明顯增大(

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05)；與模型組比較，芪紅通絡顆粒高、中、低劑量組可明顯減少腦梗死體積，差異有統計學意義(

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05)。見圖1、表2。

注:TTC染色,紅色表示正常區,白色表示梗死區;A.假手術組;B.模型組;C.尼莫地平組;D.芪紅通絡顆粒高劑量組;E.芪紅通絡顆粒中劑量組;F.芪紅通絡顆粒低劑量組圖1 各組大鼠腦梗死區情況

表2 芪紅通絡顆粒對大鼠腦梗死體積的影響

3.3 芪紅通絡顆粒對大鼠腦組織病理改變的影響 結果顯示，假手術組皮質神經細胞、神經膠質細胞排列緊密，形態正常。模型組大鼠皮質神經細胞水腫明顯，有溶解現象，細胞核模糊，膠質細胞淡染及縮小，部分有固縮；與模型組比較，尼莫地平組及芪紅通絡顆粒高、中劑量組可明顯減輕上述病理改變，低劑量組作用不甚明顯。見圖2。

圖2 芪紅通絡顆粒對大鼠腦組織病理變化的

3.4 芪紅通絡顆粒對大鼠腦組織中SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px活力明顯降低，MDA含量明顯增加，差異有統計學意義(

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05)。與模型組比較，芪紅通絡顆粒高、中、低劑量組可明顯升高SOD、GSH-Px活力，降低MDA含量，差異有統計學意義(

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05)。見表3。

表3 芪紅通絡顆粒對大鼠腦組織中SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響

3.5 芪紅通絡顆粒對大鼠腦組織中Nrf2和HO-1蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中總Nrf2、核Nrf2和HO-1蛋白表達水平有一定升高趨勢，但差異無統計學意義(

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05)；與模型組比較，芪紅通絡顆粒高、中劑量組可明顯提高腦組織中總Nrf2和HO-1蛋白表達水平，差異有統計學意義(

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05)，低劑量組作用不明顯；芪紅通絡顆粒高、中、低劑量均可明顯升高核內Nrf2蛋白表達水平，差異有統計學意義(

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05)。見圖3、表4。

注：A.假手術組；B.模型組；C.芪紅通絡顆粒高劑量組；D.芪紅通絡顆粒中劑量組；E.芪紅通絡顆粒低劑量組

表4 芪紅通絡顆粒對大鼠腦組織中Nrf2和HO-1蛋白相對表達水平的影響

4 討論

缺血性腦卒中后如何減輕繼發性腦損傷是臨床面臨的重要課題，其損傷機制復雜，國內外圍繞著缺血再灌注后神經細胞損傷與修復機制的研究雖取得一定進展，但仍缺乏有效的治療方法。中藥具有多靶點、多方向及多途徑等優點，并且不良反應小，因此充分發掘中醫藥寶庫，從中篩選具有神經保護作用的藥物具有重要臨床價值。腦梗死體積和神經功能缺陷評分測定是評價腦缺血損傷程度的常用手段，腦梗死體積可直接反映腦損傷程度，而神經功能評分值的高低與腦梗死體積則具有明顯相關性。本實驗結果顯示，芪紅通絡顆粒可明顯減小缺血再灌注損傷后的腦梗死體積，降低神經功能缺損評分，同時對大鼠腦缺血再灌注后神經細胞出現水腫、溶解及神經膠質細胞淡染、縮小等病理改變也具有明顯改善作用，表明芪紅通絡顆粒對CIRI具有較好的保護作用。

腦組織的氧化應激水平與缺血性腦卒中的發生、發展及轉歸密切相關，是造成缺血再灌注不可逆損傷的主要因素。因此，降低機體的氧化應激水平是減輕CIRI的重要措施。MDA是不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的終產物之一，可反映腦組織脂質過氧化程度，MDA濃度升高，表明脂質過氧化作用增加。SOD是氧自由基的清除劑，主要催化超氧陰離子生成HO，再由其他抗氧化酶如GSH-Px和過氧化氫酶作用生成水，其活性高低代表機體清除自由基能力，間接反映細胞損傷的程度，GSH-Px是體內存在的一種含硒清除自由基和抑制自由基反應的系統，對防止體內自由基引起膜脂質過氧化損傷至關重要，SOD和GSH-Px兩者之間明顯存在著相互保護作用和協同抗氧化作用。本實驗結果顯示，芪紅通絡顆粒可明顯減少缺血再灌注損傷后腦組織中MDA含量，顯著升高SOD、GSH-Px活性，表明芪紅通絡顆粒具有較好的抗氧化作用。Nrf2/HO-1通路在抗氧化應激損傷中發揮重要作用。生理狀態下Nrf2存在于細胞質中，并與肌動蛋白結合蛋白(Keap1)結合，不能進入細胞核發揮轉錄作用，當機體受到氧化應激時，Nrf2與Keap1解離并轉位至細胞核，在核內Nrf2可與抗氧化反應組件結合，從而促進下游HO-1的轉錄。HO-1是一種重要的Ⅱ相解毒酶，可阻斷游離血紅素參加氧化反應，并將其代謝為膽綠素、一氧化碳和鐵，從而在生物體內發揮抗氧化應激作用。研究已證實，激活Nrf2通路，上調Nrf2和HO-1蛋白表達水平可增強神經細胞對氧化應激的耐受性，從而減輕腦缺血再灌注后的氧化性損傷。腦缺血再灌注后機體由于保護性應激反應，可使Nrf激活，Nrf2和HO-1表達增加，但此反應持續時間短(72 h恢復到正常水平)，需要藥物干預。本研究結果顯示，在假手術組大鼠腦組織中，Nrf2和HO-1蛋白表達水平較低，模型組表達有所增加，但差異無統計學意義。芪紅通絡顆粒干預后，腦組織中Nrf2和HO-1蛋白表達水平明顯升高，表明芪紅通絡顆粒具有激活Nrf2/HO-1信號通路，抑制氧化應激反應的作用。

綜上所述，芪紅通絡顆粒對大鼠CIRI具有明顯的保護作用，其機制可能與其激活Nrf2/HO-1信號通路、抑制氧化應激反應，從而產生抗氧化作用有關。