靶向E3泛素連接酶的藥物研究進展

商廿潁，趙春陽，彭 英

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所，北京 100050;2. 國家藥品監督管理局藥品審評中心，北京 100022)

泛素-蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system,UPS)是真核生物體內細胞蛋白質降解的重要途徑之一，其介導的蛋白質降解在真核生物的生長和發育調節中起著重要作用，調控細胞的增殖、分化、凋亡以及DNA的修復等生理活動。作為具有高度選擇性的蛋白質降解途徑，泛素-蛋白酶體系統的紊亂會導致細胞內蛋白質動態平衡的打破，引起蛋白質水平的失衡，甚至引發癌癥、神經退行性疾病(如阿爾茨海默癥和帕金森病)、炎癥發生、病毒感染、中樞神經系統紊亂、動脈粥樣硬化和代謝功能障礙等多種疾病[1]。

泛素-蛋白酶體通路主要包括底物蛋白質泛素化以及底物經蛋白酶體降解兩大過程。泛素是一種存在于真核生物中，由高度保守的76個氨基酸組成的多肽鏈，主要功能是對待分解的蛋白質進行標記，使其被蛋白酶體降解。泛素-蛋白酶體途徑是三類酶催化完成的多酶級聯反應，主要由泛素激活酶E1、泛素轉移酶E2、泛素連接酶E3等一系列催化酶介導。在ATP水解供能的條件下，泛素首先與泛素激活酶E1通過硫酯鍵結合而被激活，活化的泛素在E1-泛素復合物中被轉移至泛素轉移酶E2，并通過硫酯鍵與E2的活性位點半胱氨酸殘基相連。當底物為一些堿性蛋白(如組蛋白)時，泛素可直接從E2轉移給底物蛋白形成泛素-蛋白復合物。一般情況下，大多數靶蛋白的泛素化需要借助特異的泛素連接酶E3來實現。E2泛素轉移酶將泛素傳遞給E3泛素連接酶，后者識別特定的底物蛋白，催化泛素羧基端的甘氨酸與賴氨酸側鏈的ε-氨基發生共價結合形成異肽鍵，最終將泛素傳遞到底物。泛素分子上的48位、63位賴氨酸可以作為修飾位點，進而在底物蛋白上形成不同種類的多泛素鏈。由于靶蛋白所連接的泛素鏈的結構和長度不同，泛素化修飾后的靶蛋白可能被降解，也可能被轉移至特定部位參與細胞其他生理活動的調節。由48位賴氨酸殘基連接的4個及4個以上的泛素共價底物蛋白所形成的K48連接多泛素結合物，最終會被26S蛋白酶體識別和降解，從而對細胞周期以及細胞凋亡等多種細胞生理活動發揮調控作用 。此外也有研究表明，泛素鏈63位賴氨酸殘基連接的靶蛋白可通過K63連接發生多泛素化，但不會進入蛋白質的降解過程。通常情況下，通過此途徑發生泛素化后的靶蛋白活性會發生改變，并對細胞內信號轉導過程和DNA修復等相關生理活動發揮調節作用。

Fig 1 The ubiquitin-proteasome system

泛素連接酶E3決定靶蛋白的特異性識別，在泛素途徑中具有重要的調控作用。人類基因組一共編碼2種E1泛素激活酶、38種E2泛素轉移酶以及600余種E3泛素連接酶。泛素連接酶E3可以直接與底物發生作用或通過輔助蛋白與底物相互作用，決定泛素-蛋白酶體系統結合的底物的特異性[2]。目前哺乳動物細胞內發現的泛素連接酶E3根據結構特點和作用機制主要包括三大類：含HECT結構域的E3、含環指結構域的E3和U-box蛋白家族E3。

泛素-蛋白酶體系統通過降解異常或受損的蛋白質來維持細胞的正常的生理活動，因此該系統的異常調控會引起各種疾病的發生，其中泛素連接酶E3所發揮的作用尤為重要。大量證據表明，E3連接酶的失調與癌癥及神經系統疾病(如少年型帕金森病)的發生存在著密切的聯系。此外，泛素連接酶E3還可能成為治療糖尿病、動脈粥樣硬化以及自身免疫性疾病的潛在藥物靶點。而絕大多數的去泛素化酶則發揮著顯著的促腫瘤作用，針對其開發抑制劑可能為抗腫瘤藥物研發提供新的研究思路[3]。

以硼替佐米為代表的蛋白酶體抑制劑已被美國食品藥品監督管理局批準上市，用于治療多發性骨髓瘤，這證明了圍繞泛素-蛋白酶體系統開展藥物研發具有一定的可行性。但由于該類抑制劑無差別地抑制所有依賴于26S 蛋白酶體的蛋白降解途徑，因此會對正常細胞造成損傷，具有較大的毒副作用。而在泛素蛋白酶系統的潛在藥物靶點中，以E3泛素連接酶作為藥物作用靶點則表現出了突出的優點：某些E3泛素連接酶的特定結構決定了針對其進行小分子抑制劑的篩選或特定靶向抗體的開發會具有更好的選擇性，且一些E3泛素連接酶在正常細胞內表達水平極低。故針對該靶點進行抑制，對正常細胞的生長及功能影響較小，可以在取得最佳治療效果的同時最大程度地降低藥物的毒副作用。因此針對泛素連接酶E3開發靶向藥物，成為了近年來的研究熱點之一。

近年來，各大制藥公司和研究機構都對靶向泛素連接酶E3藥物的研發投入了很大精力,羅氏制藥公司、賽諾菲以及強生等大型制藥公司針對泛素連接酶開發的相關藥物均處于臨床前或臨床試驗階段，能否成功上市仍然存在著較大的不確定性。本文將總結靶向E3泛素連接酶藥物的研究進展，并就目前已經完成和正在進行臨床試驗的靶向E3連接酶的藥物研究進行綜述。

1 靶向E3泛素連接酶的抗腫瘤藥物

大量證據表明，某些E3泛素連接酶的異常表達與癌癥發生關系密切，癌癥患者E3泛素連接酶的過度表達有可能增加化療耐藥和臨床預后不良的風險。MDM2 E3連接酶、Skp-Cul1-F-box(SCF)家族、HUWE1等E3泛素連接酶都在細胞周期調控及凋亡中發揮重要作用，也是目前開發靶向E3泛素連接酶抗腫瘤藥物的重要作用靶點[4]。圍繞E3泛素連接酶開發的靶向抗腫瘤藥物按照作用機制主要分為三大類：E3泛素連接酶的靶向抑制劑、E3泛素連接酶的靶向激動劑以及蛋白水解靶向嵌合體。

1.1 E3泛素連接酶抑制劑

1.1.1MDM2/ HDM2抑制劑 小鼠雙微體2基因編碼的泛素連接酶MDM2(murine double minute 2，MDM2，人源直系同源分子為HDM2)是RING型泛素連接酶的重要成員之一，具有負調控抑癌蛋白p53的功能。關于MDM2的研究目前較為深入，以MDM2為靶點的抗癌藥物研發一直是各大制藥公司的重點。抑癌蛋白p53是細胞內的典型的腫瘤抑制因子，p53在DNA損傷或癌基因激活的情況下被活化后，能夠作為異常細胞增殖的負調節因子誘導細胞發生周期阻滯、凋亡、衰老等，從而抑制腫瘤細胞的生長和增殖[5]。在生理條件下，MDM2可與p53直接結合抑制p53轉錄因子活性，同時還可以促進p53蛋白的泛素化以及降解，使p53蛋白保持在較低水平以維持正常的細胞功能。當發生DNA損傷時，MDM2和p53蛋白的結合減弱，p53蛋白的降解受到抑制而發生累積。活化的p53通過轉錄調控一系列蛋白的表達，引起細胞周期阻滯，為DNA損傷修復提供時間。因此，抑制MDM2/HDM2可能重新激活癌細胞中的p53，進而導致腫瘤細胞凋亡。多年來，許多制藥公司對MDM2抑制劑進行了大量的投資，但是還沒有成功的藥物獲批進入市場(Tab 1)。羅氏制藥公司第一個MDM2抑制劑RG7112針對實體瘤和急性髓系白血病的Ⅰ期臨床試驗分別于2007年和2008年啟動，但由于毒性過大且效果不明顯而失敗。隨后發現的抑制劑RG7388(商品名Idasanutlin)自2011年首次進行人體試驗以來，臨床療效也不盡如人意。2020年6月，羅氏制藥公司宣布Idasanutlin針對治療急性髓系白血病開展的Ⅲ期臨床試驗失敗(NCT02545283)。

Tab 1 Reported inhibitors of MDM2/ HDM2 E3 ligase

JNJ-26854165是在p53激動劑篩選中發現的新型HDM2抑制劑。2011年強生制藥公司公布了該化合物在晚期實體瘤患者中的Ⅰ期人體內藥物動力學和藥效學研究結果，JNJ-26854165在缺乏其他治療方案的晚期實體瘤患者中表現出了較好的治療效果，但其毒性的相關實驗數據仍需要進一步考證(NCT00676910)[6]。

2020年7月，亞盛醫藥集團原創新藥MDM2抑制劑APG-115的Ib期臨床研究已在中國完成首例患者給藥，后續臨床實驗尚在進行中(NCT04275518)。APG-115為高選擇性小分子MDM2-p53抑制劑，口服給藥后可見急性白血病和其他癌癥的模型中腫瘤完全持久的消退，目前主要用于治療成人復發或難治急性髓性白血病(acute myelocytic leukemia，AML)、復發或高危/極高危骨髓增生異常綜合征。該藥物同時還與默沙東制藥公司達成全球臨床合作，進一步探索APG-115聯合可瑞達聯合治療對非小細胞肺癌、黑色素瘤等患者的療效和安全性，并已進入Ⅱ期臨床試驗階段，臨床試驗結果還未公布(NCT03611868)。

HDM201(商品名Siremadlin)是諾華制藥公司開發的HDM2小分子抑制劑，在復發/難治性急性髓性白血病以及急性淋巴細胞白血病患者的Ⅰ期臨床試驗中，表現出了顯著的臨床活性以及安全性(NCT02143635)[7]。該藥物還有其他幾項Ⅰ期臨床試驗及Ⅱ期臨床試驗尚在進行過程中，結果尚未公布。

Milademetan(DS-3032b，商品名Milademetan)也是一種靶向MDM2的小分子抑制劑，它在AML、非霍奇金B細胞淋巴瘤和實體腫瘤的細胞系和移植瘤模型中均顯示出了抗腫瘤活性。Milademetan的Ⅰ期臨床試驗顯示其在復發難治性急性髓性白血病或高危骨髓增生異常綜合征以及實體腫瘤或淋巴瘤患者中均表現出了顯著的初步臨床活性[8]，Ⅱ期臨床試驗尚在進行中。

AMG-232(KRT-232)是哌啶酮類靶向MDM2的小分子抑制劑，可以誘導p53活性從而阻滯細胞周期、抑制腫瘤細胞增殖。AMG-232對復發難治性急性髓性白血病治療效果的臨床Ⅰ期試驗已經完成，受試者中未顯示出劑量限制毒性(NCT02016729)。在另一項TP53-野生型實體瘤或多發性骨髓瘤的臨床Ⅰ期試驗中(NCT01723020)，AMG-232表現出了較高的安全性。其他幾項關于AMG-232的臨床Ⅰ期及Ⅱ期實驗尚在進行中，研究結果尚未公布。

此外，還有一些靶向MDM2的抑制劑也處在臨床試驗階段。Astex公司開發的MDM2拮抗劑ASTX-295正在進行Ⅱ期臨床試驗(NCT03975387)。Aileron公司與羅氏制藥公司聯合開發的MDM2抑制劑ATSP-7041正在進行對AML的Ⅱ期臨床試驗。Boehringer Ingelheim公司開發的BI-907828也是一種口服的MDM2抑制劑，目前正在進行治療實體瘤的Ⅰ期臨床試驗(NCT03449381)。

1.1.2Cullin-RING E3 泛素連接酶抑制劑 Cullin-RING E3泛素連接酶(Cullin-RING E3 ligase，CRL)是包含 RING 結構域和Cullin蛋白家族的多元蛋白復合體，通常由Cullin家族蛋白、RING 蛋白、銜接蛋白和底物識別亞基4個部分組成。SCF泛素連接酶復合體(或稱CRL1)是目前研究較為深入的Cullin-RING E3泛素連接酶，由Cullin 家族蛋白CUL1、銜接蛋白SKPI以及個底物識別亞基F-box蛋白的F-box結構域部分組成[9]。近年來開發的Cullin-RING E3泛素連接酶抑制劑也是以靶向SCF泛素連接酶復合體的底物識別亞基F-box蛋白的小分子抑制劑為主。

SKP2是F-box蛋白家族的重要成員之一，在前列腺癌、乳腺癌以及淋巴癌等多種腫瘤細胞中均呈現出異常高表達。Chen團隊通過高通量篩選發現的小分子化合物Compound A可以特異性地抑制SKP2從而促進p21、p53等底物的積累，抑制G1/ S期的進行進而誘導細胞凋亡[10]。Wu等[11]以SKP2-Cks1-p27晶體結構的蛋白-蛋白相互作用區域為靶點借助計算機輔助虛擬篩選技術發現了小分子SKP2抑制劑C1、C2、C16和C20，該類化合物通過抑制SKP2-Cks1與底物p27的結合，誘導p27蛋白積累，從而干擾腫瘤細胞的細胞周期，促進腫瘤細胞的凋亡。有研究以SCFSKP2復合體晶體結構上的 SKP2-SKP1相互作用區域為靶點借助計算機輔助虛擬篩選技術篩選出了以化合物Compound 25為代表的一系列靶向SKP2小分子抑制劑。Compound 25可通過與SKP2結合抑制SCFSKP2泛素連接酶的活性抑制腫瘤增殖，并對腫瘤干細胞表現出了抑制其成球能力的藥理作用[11-12]。但以上抑制劑均停留在活性先導化合物發現階段，具體的作用機制也有待于進一步深入探索，距離開發成為真正的上市抗腫瘤藥物還有很遙遠的距離。

β-TrCP1和β- TrCP2也是F-box蛋白家族的重要組成成員，其底物涉及的生理功能比較復雜，既包括Emi1、周期蛋白D1等細胞周期蛋白、Twist等細胞遷移蛋白、Pro-caspase-3 等細胞凋亡蛋白、也包括PCDC4等抑癌蛋白以及CDC25A等促癌蛋白。因此，靶向β-TrCP對于不同種類的以及來源于不同組織或遺傳背景的腫瘤細胞發揮的作用可能不同。Erioflorin是Johanna團隊在天然產物中發現的一種靶向β-TrCP的抑制劑，其可以通過阻斷β-TrCP與底物細胞凋亡蛋白PCDC4的結合，促進PCDC4在細胞中的積累而發揮抗腫瘤的作用，并對乳腺癌MCF7細胞以及結腸癌RKO細胞的增殖表現出了明顯的抑制活性，但其同樣還沒有進入藥物開發階段，不能作為藥物應用[13]。

1.2 E3泛素連接酶激動劑人體中表達了600余種E3泛素連接酶，不同種類的E3泛素連接酶承擔的生理作用也各不相同。一些E3泛素連接酶，如FBW7泛素連接酶水平過低也會引起癌癥的發生。FBW7是一種擁有重復結構域的F-box蛋白，在SCF型泛素連接酶(E3)復合物中以底物識別亞基的形式存在，起到抑制腫瘤的作用。FBW7可以與周期蛋白E、c-Myc、MCL1和 KLF5等多種原癌基因或轉錄激活因子直接結合發揮作用，并對其進行泛素化修飾，進而影響后續的26S蛋白酶體降解過程。c-Myc蛋白調控細胞生長和分裂，是FBW7泛素化修飾的主要底物之一。冬凌草甲素是一種二萜類天然化合物，可通過上調FBW7連接酶的表達水平，促進過剩的c-Myc蛋白降解，實現促進腫瘤細胞凋亡以及抑制腫瘤生長的功能。

Cereblon是CUL4-DDB1 E3泛素連接酶復合體的一個底物識別亞基，靶向該靶點的免疫調節性酰亞胺類藥物沙利度胺及其衍生物來那度胺和泊馬度胺是靶向泛素連接酶CRL激動劑的代表類藥物。目前很多藥企也在研發靶向CRL激動劑類藥物，其中一些藥物已經進入了臨床前及臨床試驗研究階段(Tab 2)。

Tab 2 Activators of Cullin-RING E3 ligase

1.3 蛋白水解靶向嵌合體另一類基于E3泛素連接酶設計的抗癌藥物是蛋白水解靶向嵌合體(proteolysis-targeting chimeras，PROTACs)。PROTACs為類啞鈴結構，一端是靶向目標靶蛋白的配體，另一端是結合E3泛素連接酶的配體，再通過一定長度的linker連接。這類雙功能小分子可視為雙靶點藥物，一端與靶蛋白結合，另一端與E3泛素連接酶結合，從而拉近患者體內靶蛋白和E3泛素連接酶的距離。E3泛素連接酶將泛素轉移至靶蛋白上，使靶蛋白被標記為缺陷或受損蛋白，隨后靶蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑被降解[14]。PROTACs具有開發成為治療多種疾病的藥物的潛力，但其目前主要的開發方向為抗腫瘤藥物。

首個進入臨床試驗的PROTAC藥物是Arvinas公司開發的ARV-110，用于治療去勢抵抗性前列腺癌。2019年5月，ARV-110獲得FDA快速通道批準，進入臨床Ⅰ期研究階段驗(NCT03888612)。2020年5月23日，Arvinas公司發布的臨床Ⅰ期初始數據表明：ARV-110具有良好的口服利用度、安全性和耐受性，最大耐受劑量以及2期推薦劑量的確定仍需等待Ⅱ期臨床試驗結果的公布。ARV-110的作用機制是通過利用泛素-蛋白酶系統降解在前列腺癌發展中起關鍵作用的雄性激素受體靶點AR蛋白，同時由于其作用機制區別于傳統的抑制劑，無需通過占據雄性激素受體抑制其功能而發揮抗腫瘤效果，因此ARV-110有望克服耐藥性問題。Arvinas公司還開發了用于治療乳腺癌的PROTAC 藥物ARV-471，也進入了臨床Ⅱ期研究階段，受疫情影響，臨床有效性數據暫緩公布(NCT03888612)。

2 靶向E3泛素連接酶的阿爾茨海默病藥物

近年來的研究顯示，阿爾茨海默病、傳染性海綿狀腦病、帕金森病以及亨廷頓病等許多神經退行性疾病的發病機制均與UPS功能障礙有關。UPS功能發生障礙，不能及時清理錯誤折疊的蛋白質而使其在細胞內積累產生細胞毒性，導致神經元細胞死亡，進而誘發某些神經退行性疾病的發生[15]。阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是中樞神經系統的一種進行性神經退行性疾病，主要在老年人群中發生。臨床表現為記憶、注意力、判斷等認知功能逐漸喪失，并伴有理解、語言、認知、推理和定向力等多種功能障礙，最終導致嚴重癡呆，進而嚴重影響日常生活能力[16]。AD患者腦內的主要病理改變包括以異常磷酸化的Tau蛋白為主的細胞內神經元纖維纏結和以β淀粉樣蛋白為主的細胞外老年斑，此外也伴有特定腦區神經元及突觸丟失的情況。AD的主要發病機制尚不明確，目前普遍認為Aβ、Tau蛋白異常修飾、神經細胞凋亡、氧化應激和基因等因素均與AD發生有關。

泛素-蛋白酶體系統與AD發病關系密切，其功能障礙會導致細胞內Aβ蛋白和Tau蛋白的積累，從而誘發AD。Parkin為UPS系統中的一種RING-between-RING E3連接酶，介導底物蛋白的泛素化和Aβ蛋白的降解。Lonskaya團隊研究發現，E3泛素連接酶Parkin可以促進細胞內Aβ聚合物的降解，降低細胞內Aβ的水平，恢復受損的蛋白酶體活性，并通過UPS途徑進一步增加Aβ的清除[17]。在AD小鼠模型中，Parkin還可通過逆轉Aβ蛋白對蛋白酶體的有害影響從而改善模型小鼠受損的行為異常癥狀。Parkin還可以促進Beclin介導的自噬來清除Aβ蛋白[18]。以上研究均表明，E3泛素連接酶Parkin作為治療AD藥物的靶點是非常有潛力的，提高Parkin的活性或者增加Parkin的表達水平均可以作為開發AD藥物治療的新方向。

此外有臨床研究發現，泛素連接酶HRD1在AD患者大腦內的表達顯著降低。HRD1是細胞內質網膜定位的一種泛素連接酶，可介導多種內質網相關的異常折疊蛋白降解，促進淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)泛素化和降解，并減少Aβ的產生。HRD1表達受到抑制后所引起的內質網氧化應激，會導致Aβ毒性增加，誘發AD的產生。靶向HRD1開發增加HRD1表達的藥物從而促進APP的泛素化以及APP降解，是開發治療AD藥物的新思路。

除針對泛素連接酶開發單靶點藥物之外，以泛素連接酶為藥物作用靶點的PROTAC技術應用于AD的治療也取得了重大進展。2020年Arvinas公司發布報告稱，該公司基于泛素連接酶設計的蛋白降解靶向嵌合體可降低小鼠大腦中的tau蛋白，該tau蛋白質降解劑可在外周給藥并穿越血腦屏障。目前，該藥物處于臨床前的化合物優化階段，尚未進入臨床試驗。

3 靶向E3泛素連接酶的帕金森病藥物

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是較為常見的神經系統變性疾病，病理表現為中腦黑質多巴胺能神經元進行性地變性與脫失，并伴有α-突觸核蛋白、Parkin、泛素等包含體的出現。目前PD的發病機制尚不明確，一般認為是遺傳因素與環境因素共同作用的結果。近年的研究發現，泛素蛋白酶體系統的功能異常是PD的發病因素之一。

泛素連接酶E3 Parkin與PD的發生關系密切。Parkin編碼基因的缺失、刪減及點突變會引發常染色體隱性遺傳性少年型帕金森病(AR-JP)。臨床研究顯示，AR-JP患者腦中變性腦區和未受影響腦區Parkin的水平和酶活性均表現出明顯降低。Parkin基因突變使Parkin作為連接酶的功能受到抑制，引起蛋白酶體活性降低、氧化應激水平增加及自由基介導的蛋白質和脂質的損傷，阻止底物蛋白質的泛素化及蛋白酶體的降解。蛋白底物因不能被泛素化和降解而聚集在細胞內，產生神經毒性并最終導致神經細胞的缺失[19]。因此，靶向泛素連接酶Parkin開發藥物可作為治療PD的新策略。

Arvinas公司宣布正在開發以α-突觸核蛋白為靶點的蛋白降解靶向嵌合體，其基本設計思路仍然是借助E3泛素連接酶通過泛素-蛋白酶體系統促進α-突觸核蛋白的降解。目前PROTAC降解劑PROTAC-A和PROTAC-B顯示可以降解聚集形式的α-突觸核蛋白，但仍需要更加完善的臨床前研究。

4 靶向E3泛素連接酶的抗糖尿病并發癥藥物

E3泛素連接酶在糖尿病、胰島素抵抗和糖尿病所誘發的冠狀動脈疾病中起著關鍵作用，在胰島素抵抗中已普遍觀察到E3泛素連接酶的異常表達。E3泛素連接酶影響胰島素抵抗主要包括兩種機制:(1)通過UPS直接降解胰島素受體、胰島素受體底物等關鍵胰島素信號分子。(2)通過調節促炎介質因子如腫瘤壞死因子-α、白介素IL-6、IL-4、IL-13、IL-1β、單核細胞趨化蛋白-1和缺氧誘導因子1α間接參與胰島素信號通路的調節[20]。

許多E3泛素連接酶是胰島素抵抗治療的潛在重要治療靶點，近年來在糖尿病胰島素抵抗的治療中靶向E3泛素連接酶開發藥物越來越受到關注。雖然尚未發現可以治療胰島素抵抗的E3泛素連接酶選擇性抑制劑或活性物質，但某些可以影響胰島素信號分子泛素化的化合物可作為開發治療胰島素抵抗新方法的潛在先導化合物。例如，c-Cbl RING結構域抑制劑可以改善高脂飼料誘導的小鼠肥胖和胰島素抵抗[21]。目前，開發治療胰島素抵抗的靶向E3泛素連接酶藥物仍在初級階段，繼續深入研究E3泛素連接酶，從而發現新的治療靶點和開發特異性E3泛素連接酶抑制劑將會對治療胰島素抵抗和糖尿病具有重大意義。

此外，糖尿病已成為誘發冠心病發生的重要誘因之一，會加速冠心病的發展，導致心肌梗死、心力衰竭，甚至猝死。然而截至目前，糖尿病對冠狀動脈功能的影響機制尚不完全清楚。越來越多的實驗證據表明，平滑肌細胞中的冠狀動脈大電導鈣激活鉀通道在糖尿病冠狀動脈疾病的發生中可能發揮了重要作用。通過對E3連接酶的相關通路進行干預，如開發PKC的抑制劑或Nrf2的激動劑，可能對冠狀動脈BK-β1蛋白質的表達起到調節作用，從而保護和改善冠狀動脈血管功能。此外，激活Akt或Nrf2可通過FBXO或MuRF1通路抑制BK通道的泛素化，可能實現保護糖尿病患者冠狀動脈的藥理作用[22]。圍繞以上靶點進行藥物開發，可為糖尿病冠狀動脈病變治療藥物的研發提供新策略。

5 靶向E3泛素連接酶的動脈粥樣硬化藥物

近十年的研究發現，E3泛素連接酶Cbl-B、Itch以及GRAIL均在T細胞活化的過程中起到了重要的調節作用。RING型E3泛素連接酶Cbl-B主要在人和小鼠動脈粥樣硬化斑塊內的T細胞和巨噬細胞中表達。在人動脈粥樣硬化斑塊中，Cbl-B的表達與壞死核心大小呈負相關，這說明Cbl-B可能阻礙動脈粥樣硬化的發展。在動脈粥樣硬化形成的初始階段，Cbl-B的缺乏會增加CCR1、CCR2以及 CCR7等單核細胞趨化因子受體的表達，促進這些細胞向血管炎癥部位聚集，增加了斑塊中巨噬細胞的豐度[23]。因此，Cbl-B的缺乏會加速動脈粥樣硬化的疾病進程，而增強Cbl-B的活性則可能是動脈粥樣硬化的一種新治療策略。

Itch是一種HECT E3泛素連接酶，調控T細胞活化過程，其突變會引起小鼠以及人類的多系統自身免疫疾病。Itch會促進泛素介導的IL2受體信號轉導中間產物Janus激酶1的降解，進而限制T細胞增殖。Itch還可以通過調節T細胞表面受體活化，促進調節性T細胞的增殖。此外，GRAIL也是一種對T細胞活化起到調控作用的RING型E3泛素連接酶，其主要的生理作用是負調控T細胞活性。截止目前為止，尚沒有研發靶向Cbl-B或GRAIL并增強其活性的藥物。但隨著E3泛素連接酶與動脈粥樣硬化相關研究的不斷深入，研發靶向E3泛素連接酶的藥物將會為動脈粥樣硬化的臨床治療帶來新的曙光。

6 靶向E3泛素連接酶的炎癥性腸病藥物

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases，IBD)是一類以慢性炎癥為特征的腸道類疾病，主要包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎。該類疾病遷延不愈，病變累及胃腸道多個部位，極大地降低了患者的生活質量，嚴重者會導致死亡。IBD的確切發病機制尚不清楚，目前的研究顯示遺傳因素和環境因素均會影響IBD的發病，E3泛素連接酶的異常也是引起IBD的重要因素之一。例如NF-κB信號通路參與炎性因子的轉錄，是調控IBD發生的重要信號通路，而多種E3泛素連接酶均可以通過影響NF-κB信號通路的泛素化修飾進而對IBD的發生產生影響[24]。泛素連接酶Itch通過干涉NOD7與RIP7的結合從而影響NF-κB信號通路的活化。泛素連接酶RNF183也會激活NF-κB信號通路從而誘發炎癥性腸病。

E3泛素連接酶在炎癥性腸病中的重要作用說明其作為炎癥性腸病藥物的開發靶點是非常有潛力的。Koutif Therapeutics公司靶向泛素連接酶開發的KT-1002是一個口服的F-box protein 3抑制劑，可以促進多種促炎蛋白降解，目前已開始克羅恩病和潰瘍性結腸炎的Ⅰ期臨床試驗。此外，由于該藥具有突出的抗炎作用， Koutif Therapeutics公司也對其在急性肺損傷、類風濕關節炎、閉塞性細支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病等炎癥性疾病以及神經性疼痛方面開展了臨床前研究。

7 靶向E3泛素連接酶藥物研發的挑戰與機遇

目前處于開發階段的靶向泛素連接酶的藥物存在一定的問題：針對泛素連接酶開發的小分子抑制劑存在著脫靶情況，可能會引起毒副作用。此外，一些E3連接酶(如Cullin-RING E3 泛素連接酶)是以復合體的形式發揮生理作用，泛素化過程是依賴于蛋白-蛋白相互作用進行的，不斷改變的蛋白空間構象使小分子藥物很難與之結合，因此這類以蛋白質復合物形式存在的E3連接酶缺少明確的小分子抑制劑結合位點。以上情況均為設計開發靶向泛素連接酶的藥物帶來了巨大挑戰，也是近些年小分子靶向泛素連接酶抑制劑開發失敗或臨床試驗結果不理想的重要原因。目前為止，進入臨床試驗階段的靶向泛素連接酶的藥物并不多。

近幾年逐漸興起的PROTAC技術則為靶向泛素連接酶藥物的開發提供了新思路。PROTAC技術通過選擇組織特異性或腫瘤選擇性E3連接酶作為靶點設計相應的配體，可以實現對目標蛋白的選擇性降解。這種蛋白質降解技術與小分子靶向泛素連接酶抑制劑相比的突出優點是PROTACs可對耐藥靶點表現出特異的敏感性。與單純的小分子抑制劑作用機制不同，PROTACs通過清除靶蛋白影響酶活性功能和非酶功能，因此該項技術有望解決抗腫瘤藥物的耐藥性問題[25]。PROTACs在體內還可以反復利用，并能夠在較低劑量發揮出很好的療效。但目前PROTACs也存在著一些成藥性障礙：PROTACs的分子量比一般的小分子靶向泛素連接酶抑制劑更大，因此組織滲透性和細胞滲透性仍然存在較大問題，且其作為藥物的臨床安全性也仍然需要進一步考證。但無論如何，PROTACs為靶向泛素連接酶的藥物研發提供了一種新的設計思路，值得繼續深入研究。Arvinas公司研發的ARV-110及ARV-471臨床試驗的順利推進也證明了PROTACs作為新型靶向泛素連接酶藥物的潛力。PROTACs的廣闊前景近年來吸引了眾多藥企投入研發。Kymera Therapeutics公司開發了靶向泛素連接酶IRAK4的PROTACs藥物KYM-001，用于治療MYD88 基因突變的 B 細胞淋巴瘤，目前在臨床前研究階段。Nurix公司開發的用于治療B細胞惡性腫瘤的口服BTK嵌合靶向分子以及可刺激T細胞活化和IL-2分泌的口服CBL-B連接酶抑制劑也處于臨床前階段研究階段。進一步挖掘更多的E3連接酶作為PROTACs的開發靶點以及進一步改善藥代動力學和生物利用度，將是未來的重要研發方向。

天然產物也是靶向E3泛素連接酶的藥物開發的重要來源。近年來一些靶向泛素連接酶的抑制劑如密花棉毛葉菊素醋酸酯、染料木素和Suramin，以及靶向泛素連接酶的激動劑如植物生長素吲哚乙酸、茉莉酮酸酯、獨角金內酯、赤霉素和冬凌草甲素，其來源均是天然產物。

8 我國研發現狀及展望

目前，我國各大制藥企業在靶向E3泛素連接酶的藥物研發方面也投入了巨大精力。除亞盛醫藥集團的原創新藥APG-115外，國內其他藥企也加大了研發力度。甘李藥業2019年7月為新發現的代表化合物申請了泛素連接酶MDM2(HDM2)抑制劑專利，該化合物對SJSA-1人骨肉瘤細胞具有明顯的抗增殖活性，其后續研究仍在進行中。蘇州開拓藥業正在研發以AR-Degrader為代表的PROTAC新藥，也在臨床前研究階段，尚未進入臨床研究。

9 小結

E3泛素連接酶數量眾多，作為很多疾病的潛在靶點，為未來多種疾病的新藥發現提供可能。高通量篩選、計算機虛擬篩選技術等篩選技術的發展，加快了泛素連接酶小分子抑制劑或激動劑的發現速度，而PROTACs技術在臨床的成功轉化，則為靶向泛素連接酶藥物的設計思想提供了新的思路和線索。這些進展都將對靶向泛素連接酶藥物的開發以及提高靶向泛素連接酶藥物的臨床安全性起到極大的推進和鼓舞作用。

目前針對泛素連接酶開發靶向藥物主要圍繞抗癌藥物展開，但隨著近些年的研究深入，泛素連接酶在神經退行性疾病、糖尿病、炎癥及自身免疫性疾病等方面的重要程度日益凸顯。大量實驗證據初步顯示，一些泛素連接酶抑制劑或激動劑確實在治療這些疾病方面表現出了良好的先導化合物活性。這提示研究者應該更加關注泛素連接酶作為神經退行性疾病、糖尿病等疾病的治療靶點的可能，這將會為這些疾病的新藥開發帶來新思路。泛素連接酶數量眾多，進一步深入研究泛素連接酶在疾病發生過程中所發揮的作用，并發掘更多可作為疾病藥物開發靶點的E3泛素連接酶，也是未來的努力方向。此外，我國在天然產物的研究與開發方面具有突出的優勢，值得深入挖掘。借助高通量篩選以及計算機模擬對接技術以各泛素連接酶對天然產物庫進行篩選，并更加側重這些天然產物作為E3 泛素連接酶抑制劑或激動劑的可能性，將為來源于天然產物的靶向泛素連接酶的小分子藥物的發現提供機遇。