FGL1對多西他賽誘導肺腺癌細胞侵襲和遷移能力的影響及機制

程 浩，李 軒，方 樂，郝吉慶

(安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤內科,安徽 合肥 230022)

世界癌癥數據庫統計結果顯示，2018年全球新增1 810萬惡性腫瘤病例，其中肺癌的占比達到了11.6%，死亡率占比高達18.4%，均處于第一位,中國更是全球肺癌第一大國，其發病與死亡人數約占全球總人數近40%[1]。其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌的85%，但5年生存率僅約為15%[2]。多西他賽(Docetaxel)作為NSCLC患者標準二線化療藥物，長期使用容易產生耐藥性[3]。纖維蛋白原樣蛋白1(fibrinogen like protein 1， FGL1)是一種重要的促進細胞增殖和免疫調節因子，可通過旁分泌形式抑制腫瘤細胞增殖，在促進細胞有絲分裂、腫瘤血管生成、上皮間質轉化和腫瘤免疫逃逸等方面起關鍵作用[4-5]。本課題組前期研究發現，FGL1在肺腺癌細胞內表達上調，且抑制FGL1表達能明顯提高多西他賽對肺腺癌細胞抑制率[6]，但對FGL1是否參與多西他賽誘導的其他生物學行為尚不清楚。本實驗旨在探討FGL1對多西他賽誘導的肺腺癌細胞侵襲、遷移能力的影響及其機制，為臨床治療尋找新的治療靶點提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 由中國科學院上海細胞庫提供本次實驗所需的人肺腺癌細胞株PC-9以及A549。

1.1.2藥物與試劑 多西他賽購自北京索萊寶有限公司(貨號ID0400),RPMI培養基購自Hylcone(貨號SH3002202),胰蛋白酶購自Sigma(貨號T4799)，胎牛血清購自賽默飛世爾科技-Gibco(貨號10270106 ),二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA) 試劑盒購自Beyotime(貨號P0010S),多聚甲醛購自Aladdin公司(貨號C104188)，Transwell小室購自Corning公司(貨號3422)，PVDF膜購自Millipore公司(貨號IPVH00010)，RT-qPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司(貨號RR820A),E-cadherin抗體購自Abcam公司(貨號ab184633)，N-cadherin抗體購自Abcam公司(貨號ab173341)，FGL1抗體購自Abcam公司(貨號ab197357)，β-actin抗體購自Proteintech公司(貨號60008-1-lg),FGL1-siRNA重組序列、隨機陰性對照序列由上海吉凱基因公司提供，見Tab 1。

Tab 1 The primer sequence of FGL1 and GAPDH

1.1.3儀器 細胞培養超凈工作臺(上海智誠)，制冰機(常熟凌科)，高壓滅菌鍋(廈門致微)，倒置熒光顯微鏡(德國蔡司公司)，CO2培養箱(上海力申)，實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)，純水器( 美國Millipore 公司)，普通離心機( 德國Heraeus公司)。

1.2 方法

1.2.1數據獲取與整理 檢索癌癥基因組圖譜數據庫(The Cancer Genome Atlas,TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov 和Gene Expression Omnibus,GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi)下載并整理FGL1基因相關測序信息和臨床數據，從TCGA數據庫下載包括515例肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)患者的腫瘤組織和59例正常組織測序信息，503例肺鱗狀細胞癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)和52例正常組織測序信息，同時針對FGL1在24種癌癥中差異表達進行分析處理。此外，從GEO數據庫中下載具有完整臨床信息的204例肺腺癌患者總生存時間和預后結果，并根據FGL1表達水平將患者分為FGL1高表達組和FGL1低表達組。

1.2.2細胞培養 細胞培養基采用RPMI 1640培養基，培養基包含1%青-鏈霉素、10%胎牛血清，培養溫度37 ℃，并給予5% CO2。

1.2.3免疫印跡法檢測FGL1蛋白表達 Western blot法步驟如下：向肺腺癌細胞PC-9和A549細胞中加入蛋白裂解液放入4 ℃層析柜中的搖床上，4 ℃離心機離心30 min后取上清，然后將蛋白液與上樣緩沖液充分混勻，100 ℃加熱10 min，每泳道加入適量樣品進行凝膠電泳，轉膜、封閉2 h后,4 ℃孵育一抗過夜，β-actin與一抗FGL1稀釋1 000倍。一抗孵育之后每10 min用TBST溶液進行一次洗膜，30 min后添加二抗(羊抗鼠或者羊抗兔)，在常溫下孵育90 min，然后用TBST溶液進行漂洗，化學發光法在紫外凝膠成像儀上進行拍照分析，每次實驗需3次重復。

1.2.4實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測FGL1基因的表達 將處于對數期生長的人肺腺癌PC-9和A549細胞消化后接種至6孔板中，使細胞密度能夠達到80%-90%。收集細胞利用TRIzol試劑、氯仿、異丙醇試劑提取RNA，然后根據試劑盒說明進行逆轉錄，以cDNA 為模板用LightCycler480 System RT-PCR儀器進行擴增，每個PCR 循環的條件為95 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 40 min，進行40次循環后停止，每個樣品設3個復孔。選用由公式Folds=2-△△CT計算FGL1基因相對表達量。

1.2.5細胞轉染 取肺腺癌PC-9和A549對數期生長期細胞，稀釋成1.0×108個·L-1的細胞密度接種至6孔板內，轉染細胞的密度為40%-60%，siRNA轉染應符合lipofectamineTM2000轉染程序，轉染48 h后添加蛋白裂解液提取蛋白或加TRIzol提取RNA，并通過Western blot法和RT-qPCR法驗證轉染效果。

1.2.6Transwell遷移實驗 給予PC-9和A549各30 μmol·L-1多西他賽，藥物作用24 h后將各組細胞用0.2%胰酶消化制備成細胞懸液，PC-9和A549細胞數均為4×103個/孔。將600 μL的含FBS的培養基加入各孔內，將小室放入24孔板中，然后將PC-9和A549細胞懸液添加入上室繼續培養，24 h后將上室拿出，將上室膜上細胞輕輕除去，在常溫下用4%多聚甲醛進行固定，時間25 min，然后用0.4%結晶紫染液進行染色，5 min后洗去浮色。在顯微鏡下進行細胞計數，每孔任意選擇6個視野進行計數，每組3個復孔，取平均值。

1.2.7細胞劃痕實驗 將細胞鋪在6孔板上，在血清饑餓24 h之前讓細胞生長至匯合細胞單層。接著用10 μL的無菌移液器或者針尖進行劃痕，去除培養基，用PBS清洗3次，以消除漂浮細胞。觀察傷口寬度的變化規律，24 h后測量劃痕區的寬度，遷移率/%=(初始劃痕寬度-24 h后劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%。

1.2.8Transwell侵襲實驗 先構建侵襲實驗小室模型，將事先準備Matrigel膠4 ℃過夜溶解，用預冷的無血清培養基稀釋后取100 μL加入到小室膜上。實驗分組與遷移實驗相同分為6組，分別給予PC-9和A549各30 μmol·L-1多西他賽，藥物作用24 h后將各組細胞用0.20%胰酶消化制備成細胞懸液，PC-9和A549細胞數都采用 2×104個/孔。在24孔板中加入800 μL培養基(10% FBS)，在24孔板內放入Transwell小室，在上室加入細胞懸液200 μL，在細胞培養箱內培養1 d。將上室膜上細胞輕輕除去，在常溫下用4%多聚甲醛進行固定，時間25 min，然后用0.4%結晶紫染液進行染色，蒸餾水沖洗。最后在顯微鏡下對穿過基膜的細胞計數，每張膜選取6個視野計數，每組3個復孔，取平均值。

2 結果

2.1 FGL1在非小細胞肺腺癌中表達情況為了鑒定FGL1在腫瘤和正常組織之間是否存在差異表達，利用R語言(R3.6.3,https://www.r-project.org)中的edgeR包對TCGA數據庫FGL1在各腫瘤組織中的差異表達進行分析,如Fig 1所示，通過泛癌分析證實FGL1在肺腺癌、結腸癌、胃癌、食管癌和前列腺癌組織中表達上調，在肺腺癌和前列腺癌中FGL1升高的尤為顯著，提示FGL1可能在腫瘤發生發展起著不可或缺的作用。

Fig 1 Differential expression of FGL1 in normal tissues and tumor

2.2 FGL1基因在肺腺癌中的表達與預后關系在GEO數據庫GSE31210數據集中下載FGL1的臨床樣本數據，搜集FGL1高表達和FGL1低表達肺腺癌患者各102例。由Fig 2可見，利用Kaplan Meier Plotter在線分析工具對患者的生存時間數據進行處理，提示在肺腺癌患者中FGL1高表達組預后較差(P<0.05)。

Fig 2 Analysis of survival curves of different expression levels of FGL1 gene in patients with lung adenocarcinoma

2.3 在肺腺癌細胞中敲降FGL1表達以FGL1基因為靶點的siRNA和非沉默 的對照siRNA分別干擾肺腺癌PC-9和A549細胞。如Fig 3所示，與對照組相比，PC-9和A549細胞中siFGL1組的FGL1蛋白表達量分別降低為(0.28±0.029)和(0.24±0.012),差異具有顯著性(P<0.01)。運用RT-qPCR技術檢測FGL1 mRNA水平，PC-9細胞siFGL1組FGL1mRNA表達水平下降至Con組的(0.30±0.08)，A549組中siFGL1組FGL1mRNA表達量下降至Con組的(0.39±0.037)，差異均具有顯著性(P<0.01)。

Fig 3 Effect of silencing FGL1 in lung adenocarcinoma PC-9 and A549 cells on FGL1

2.4 FGL1對多西他賽誘導的肺腺癌細胞侵襲能力的影響予以多西他賽藥物作用24 h后，采用Transwell侵襲實驗檢測FGL1對肺腺癌PC-9和A549細胞侵襲能力的影響。如Fig 4所示，與對照組相比，PC-9和A549細胞的siFGL1組和D組細胞侵襲能力均下降，且兩者聯合的siFGL+D組對細胞侵襲能力的抑制作用更加明顯，差異均有統計學意義(P<0.01)。且兩種細胞的Con組和NC組比較、NC+D組與D組比較均有P>0.05，差異無統計學意義。提示敲減FGL1表達后可明顯降低的侵襲能力，聯合多西他賽后PC-9、A549 兩種肺腺癌細胞的侵襲能力下降更為明顯。

Fig 4 Effect of silencing FGL1 on invasion ability of lung adenocarcinoma PC-9 and A549

2.5 FGL1對多西他賽誘導的肺腺癌細胞遷移能力的影響予以多西他賽處理肺腺癌細胞24 h，首先通過沒有Marteigel的Transwell小室檢測FGL1對細胞遷移的影響。如Fig 5A，B所示，可見PC-9和A549細胞的siFGL1組和D組發生遷移的細胞數量均減少，且兩者聯合的siFGl1+D組發生遷移的肺腺癌細胞數目減少，差異均有統計學意義(P<0.01)。而兩種細胞的Con組與NC組比較、D組與NC+D組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。為了進一步驗證觀察結果，采用細胞劃痕實驗，通過鏡下觀察傷口的愈合情況來判定FGL1對細胞遷移的的影響。如Fig 5C,D所示，與對照組相比siFGL1組、D組劃痕間隙明顯增寬,且siFGL1+D組細胞遷移至劃痕口的細胞數量最少，劃痕裂隙最寬，差異均有統計學意義(P<0.01)。從細胞形態學來看，與Con組、D組細胞相比較，siFGL1組和siFGL1+D組細胞明顯變圓，細胞更加聚集，遷移能力也明顯下降。這些特征可能和細胞上皮表型化密切相關。

Fig 5 The migration ability of lung adenocarcinoma PC-9 and A549 cells inhibited by silencing

2.6 FGL1對多西他賽誘導的肺腺癌細胞E-cadherin與N-cadherin表達水平的影響通過Western blot對EMT相關蛋白的表達進行檢測，結果顯示，與Con組與NC組相比，PC-9細胞(Fig 6A,C)與A549細胞(Fig 6B,D)的siFGL1組E-cadherin蛋白表達強度增高而促進細胞遷移蛋白N-cadherin表達強度減弱，差異均有顯著性(P<0.01)；且siFGL1+D組E-cadherin蛋白表達增高和N-cadherin表達下調的更為顯著，差異均有統計學意義(P<0.01)；另外，D組EMT相關蛋白表達無明顯變化，提示多西他賽對PC-9和A549細胞的EMT進程無明顯影響。而抑制FGL1可能會通過遏制EMT進程從而降低肺腺癌細胞的侵襲遷移能力，且聯合多西他賽后對肺腺癌細胞侵襲遷移能力抑制更顯著。

Fig 6 Effect of interference with FGL1 expression on expression of E-cadherin and N-cadherin in lung adenocarcinoma

3 討論

惡性腫瘤的主要特征之一就是腫瘤細胞會在不同器官間進行轉移，腫瘤致死的病例中大多與原發腫瘤的擴散與轉移有關，故探索腫瘤轉移的實質有著重要意義[7]。近年來有研究報道上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)可改善腫瘤細胞微環境和特異性增強其侵襲、轉移能力，并且EMT與化療耐藥存在共同信號傳導途徑[8]。EMT相關分子標志物有上皮性鈣黏蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白-1(zonula occludens-1)、波形蛋白(vimentin)和神經性鈣黏蛋白(N-cadherin)等。由于EMT的激活，上皮鈣黏蛋白的表達受到抑制，導致典型的上皮細胞多邊形、鵝卵石形態缺失，細胞獲得紡錘形的間充質細胞形態，且 N-cadherin,vimentin等蛋白表達增強[9]。非小細胞肺癌的二線標準化療方案主要是多西他賽，該藥物對微管的聚合有促進作用，并對解聚產生抑制，使細胞停留在G2/M期，阻止腫瘤細胞有絲分裂。但多西他賽長期使用后易產生獲得性化療耐受，從而對化療療效產生極大影響。研究發現影響多西他賽療效作用的機制之一為腫瘤細胞發生EMT樣形態學改變，降低肺癌細胞E-cadherin的表達增強NSCLC細胞侵襲遷移能力及藥物耐受性[10]。而細胞發生EMT也需要內源或外源性的誘因，外源性誘因如缺氧，DNA甲基化等，內源性誘因包括某些基因的突變或低表達等[11]。

作為纖維蛋白原家族成員，FGL1參與多種腫瘤的發生、發展及轉移過程，對腫瘤免疫微環境調節有一定影響，并對腫瘤血管生成和細胞的增殖、侵襲轉移能力發揮重要作用。據報道，NSCLC組織中FGL1的表達顯著上調，并與NSCLC患者的生存期和不良預后密切相關[5]，本研究通過對TCGA和GEO數據庫中FGL1相關信息整理分析也再次驗證了這一結論。FGL1又稱肝細胞衍生纖維蛋白原相關蛋白1(hepatocyte-derived fibrinogen-related protein 1，HFREP-1)，是由腫瘤細胞或肝細胞合成并分泌，屬于纖維蛋白原家族。它位于人染色體8p21.3-p22,基因全長34 007 bp,由8個外顯子組成。原本是肝臟分泌的一種促進肝細胞有絲分裂的特異生長因子，通過自分泌形式刺激原代肝細胞增殖[12-13]。但它與纖維蛋白原家族其他成員不同是FGL1可與細胞膜上相應受體結合后激活其下游通路，下游通路目前為止發現的主要為ERK1/2信號通路[4]，至于其對腫瘤細胞發揮效應的確切機制目前尚無結論。Wang等[5]研究首次發現FGL1是LAG-3(lymphocyte activation gene 3)分子的主要功能“配體”，LAG-3蛋白存在于免疫系統T細胞表面上，二者相結合形成了一條新的免疫逃逸通路，腫瘤細胞利用此通路來保護自己免受T細胞攻擊，因此靶向FGL1將有助于激活T細胞的抗腫瘤能力。此外有研究發現FGL1在肝激酶B1(liver kinase B1，LKB1)突變型的肺癌細胞中表達也明顯上調，且通過實驗證實了FGL1通過抑制LKB1突變型肺腺癌細胞上皮質轉化，進而抑制肺癌細胞增殖[14]。Zhang等[15]研究也表明，相較于正常組織，FGL1在胃癌組織中表達明顯升高。通過體外實驗首次證實了FGL1可通過調控胃癌細胞的上皮間質轉化，促進胃癌的增殖、侵襲和轉移，且高表達FGL1可作為預測胃癌患者的不良預后的獨立指標。因此，我們推測FGL1突變可能是細胞發生EMT樣改變的一種誘因，并可能通過影響細胞EMT樣變化，從而對多西他賽誘導的肺腺癌細胞侵襲和遷移能力有一定作用。本研究發現在多西他賽相同劑量作用下，下調FGL1表達后的顯著降低了肺癌PC-9和A549細胞侵襲和遷移能力，并且降低間質標志物N-cadherin蛋白表達，而增強上皮標志物E-cadherin蛋白表達，且均具有顯著性差異，提示敲降FGL1逆轉了多西他賽誘導的肺腺癌細胞EMT進程。

綜上所述，FGL1表達受到阻遏后可明顯增強多西他賽對肺腺癌PC-9和A549細胞的侵襲和遷移抑制能力，這可能與敲減FGL1表達后明顯抑制了上皮間質轉化有關。本實驗不足之處在于尚未建立體內模型驗證，對于FGL1如何調控肺腺癌EMT樣改變，進而抑制肺癌細胞的侵襲遷移的具體機制有待后續進一步研究探索。