長鏈非編碼RNA Kcnq1ot1對小鼠糖尿病心肌病的作用

楊 帆，王麗宏

(1. 南京大學醫學院附屬鼓樓醫院內分泌科，江蘇 南京 210008；2. 哈爾濱醫科大學附屬第二醫院內分泌科，黑龍江 哈爾濱 150001)

糖尿病已經成為危害公共健康的全球性問題，成為威脅人類健康的“第三大殺手”。流行病學調查顯示，糖尿病患者發生心力衰竭的風險明顯高于正常人，超過50%-80%糖尿病患者最終死于糖尿病的心血管并發癥[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的一個重要心血管并發癥，是導致糖尿病患者出現心衰、惡性心律失常、猝死的重要原因之一。目前尚缺乏治療DCM的有效辦法，因此，積極探索DCM的發病機制、尋找新的治療靶點，對DCM的防治無疑具有重要的科學意義。

焦亡是與炎癥相關的細胞程序性死亡，可觸發細胞膜孔形成，促進胞質促炎因子的釋放和細胞裂解[2]。焦亡過程中，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)可募集并與含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1)的前體(pro-caspase-1)相互作用，形成NLRP3炎性體并促進pro-caspase-1的自催化裂解，產生活化的caspase-1，后者可將pro-IL-1β和pro-IL-18加工為成熟體IL-1β和IL-18。同時，活化的caspase-1可以將消皮素D(gasdermin D，GSDMD)切割成兩個片段，產生的氨基末端片段通過其成孔作用破壞細胞膜，促進細胞焦亡[3]。以往的研究表明，焦亡在DCM中激活，抑制焦亡后糖尿病動物模型心臟形態和功能明顯改善[4-6]。值得注意的是，焦亡與心肌纖維化密切相關：IL-1β和IL-18激活可以促進氧化應激，導致成纖維細胞增殖和膠原的產生。然而，目前關于DCM心肌纖維化與焦亡的調控機制尚未完全闡明。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一種轉錄本長度 > 200個核苷酸的非編碼RNA，不能編碼蛋白質，但可以在表觀遺傳學、轉錄及轉錄后水平調控基因的表達，參與多種病理生理過程。LncRNA Kcnq1ot1與多種心臟疾病密切相關，包括急性心肌損傷和心律失常等[7-8]。然而，Kcnq1ot1在DCM中的作用及機制尚不清楚。本研究的主要目的是闡明lncRNA Kcnq1ot1對DCM心肌焦亡、炎癥和纖維化的調控作用，為DCM提供了新的思路和潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物C57BL/6小鼠(18-20)g，♂，購于哈爾濱醫科大學實驗動物中心，許可證號 SCXK(黑)2019-001，在哈爾濱醫科大學北方醫學轉化中心動物飼養房喂養。專人飼養，自由進食、自由進水。動物飼養房在標準狀態下，溫度維持在(23±1)℃，濕度維持在(55±5)%，通風狀態良好，每天光照12 h、黑暗12 h交替進行。實驗過程嚴格遵守中國《實驗動物福利倫理審查指南》和美國《實驗動物飼養管理和使用指南》(第8版)，并通過哈爾濱醫科大學倫理委員會批準。

1.2 試劑鏈脲佐菌素(北京索來寶)，貨號：S8050；慢病毒(中國上海吉瑪)，貨號：P4240-100UG；TRIzol(美國Invitrogen)，貨號：15596026；ReverTra Ace qPCR RT kit(日本Toyobo)，貨號：FSQ-101；SYBR qPCR Mix(日本Toyobo)，貨號：QPK-201；RIPA裂解液(美國Thermo)，貨號：FNN0011；蛋白酶和磷酸酶抑制劑(瑞士Roche)，貨號：5892791001；蛋白Marker(美國Thermo)，貨號：J449-0.8ML；ECL顯色液(中國Tanon)，貨號：180-5001；BCA試劑盒(中國碧云天)，貨號：P0009；PVDF 膜(美國Millipore)，貨號：ISEQ00010；山羊抗兔、抗鼠IgG二抗(美國Invitrogen)，貨號：AAT-16720；NLRP3、caspase-1、IL-1β、GSDMD-N、collagen Ⅰ 、collagen Ⅲ、TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3抗體(美國CST)，貨號：15101、2255、12703、3642、72026、30565S、3108、5336、9520、5339、9523；GAPDH抗體(中國ZSGB-BIO)，貨號：TA-08。

1.3 儀器7500 Fast實時定量PCR儀(美國ABI)；Odyssey成像系統(美國LI-COR)；冰凍切片機(德國Leica)；高分辨率小動物超聲成像系統(加拿大VisualSonics)；電子血糖儀及試紙(德國羅氏)；臺式低速冷凍離心機(中國奧盛儀器)；轉移電泳槽和電泳儀(美國Bio-Rad)。

1.4 動物模型的制備和分組6-8周齡雄性C57BL/6小鼠，體質量(18-20)g，適應性喂養1周。1周后將小鼠隨機分組，分別為正常組(control組)、糖尿病組(DM組)、糖尿病小鼠注射Kcnq1ot1-shRNA慢病毒組(DM+Kcnq1ot1-shRNA組)和糖尿病小鼠注射對照Scr-shRNA慢病毒組(DM+Scr-shRNA組)。采用小劑量多次連續腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)方法建立糖尿病模型，STZ溶于檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.2)中，50 mg · kg-1·d-1連續腹腔內注射5 d，正常對照組給予等體積的檸檬酸鹽緩沖液注射，最后一次注射72 h后，尾靜脈采血檢測空腹血糖>16.7 mmol·L-1則糖尿病造模成功。隨后，小鼠尾靜脈注射Kcnq1ot1-shRNA慢病毒，建立動物體內干擾Kcnq1ot1模型；DM+Scr-shRNA組注射對照Scr-shRNA慢病毒，control組和DM組注射等劑量的生理鹽水。合成Kcnq1ot1-shRNA慢病毒。1×1012TU ·L-1慢病毒溶于50 μL生理鹽水，小鼠尾靜脈注射[9]。Kcnq1ot1-shRNA的序列為5′-GGTAGAATAGTTCTGTCTT-3′。經尾靜脈給予小鼠上述藥物后繼續喂養8周，建立DCM模型。

1.5 超聲心動圖檢測小鼠腹腔注射10%的水合氯醛進行麻醉，應用高清小動物超聲成像系統Vevo1100留取左室長軸二維超聲圖像，計算左室射血分數(ejection fraction，EF%)和短軸縮短率(fractional shortening，FS%)。

1.6 HE染色制備石蠟切片。將石蠟切片脫蠟，蒸餾水洗滌，給予HE染色，流水沖洗30 s，梯度乙醇及二甲苯浸泡，處理后封片、晾干，留取HE染色圖像，觀察心肌形態。

1.7 Masson染色石蠟切片脫蠟至水，洗滌后給予Masson染色劑染色，0.2%冰醋酸洗滌并用0.1%磷鎢酸分化，亮綠染液染色，待纖維化病灶染至淡綠色用0.2%冰醋酸洗滌，梯度酒精脫水，處理后封片、晾干，留取Masson染色圖像，觀察心肌纖維化程度。

1.8 RNA提取和實時定量PCR取小鼠的左心室組織，TRIzol提取總RNA，測定RNA濃度和純度，應用Toyobo逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，反應程序為 37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min，4 ℃ Holding。應用Toyobo SYBR qPCR Mix試劑盒進行qRT-PCR。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對含量。主要引物序列如Tab 1所示。

Tab 1 Specific primer sequences for qRT-PCR

1.9 蛋白質印跡分析用RIPA裂解液提取心臟組織蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，并上樣、電泳、轉膜，分別加入NLRP3(1 ∶800)、caspase-1(1 ∶500)、IL-1β(1 ∶800)、GSDMD-N(1 ∶500)、collagen Ⅰ(1 ∶1 000)、collagen Ⅲ(1 ∶1 000)、TGF-β1(1 ∶800)、p-smad2/3(1 ∶800)、smad2/3(1 ∶800)、GAPDH(1 ∶ 2 000)一抗，4 ℃過夜，TBST洗膜加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1 ∶2 500)二抗，37 ℃孵育1 h，ECL顯色，拍照。

1.10 免疫組織化學染色將小鼠左心室組織放入4%多聚甲醛中固定、包埋、冰凍，切成5 μm的薄片置于載玻片，4%多聚甲醛固定20 min，穿透液穿透1 h。山羊血清封閉2 h，加入NLRP3、caspase-1、IL-1β和GSDMD-N一抗(1 ∶200)，4 ℃過夜，二抗濕盒中常溫孵育1 h，加入DAPI，室溫下靜置30 min，顯微鏡觀察。

2 結果

2.1 糖尿病小鼠干擾Kcnq1ot1的表達本實驗構建DCM的動物模型，通過對C57BL/6小鼠尾靜脈病毒注射實現體內干擾Kcnq1ot，每組5只。qRT-PCR檢測發現，與對照組相比，Kcnq1ot1在糖尿病小鼠的心臟組織明顯升高，給予Kcnq1ot1-shRNA后被明顯抑制(Fig 1)。

Fig 1 Silencing Kcnq1ot1 in

2.2 干擾Kcnq1ot1對糖尿病小鼠心臟功能的影響為了研究Kcnq1ot1對糖尿病小鼠心臟功能的影響，將各組小鼠麻醉后進行超聲心動圖檢測。結果表明，與對照組相比，DM組小鼠左心室功能明顯減退，表現為心臟收縮和舒張功能下降，EF和FS明顯降低；體內干擾Kcnq1ot1后，糖尿病小鼠心臟功能明顯改善(Fig 2A-C)。

Fig 2 Cardiac function attenuated by silencing Kcnq1ot1 in diabetic mice

2.3 干擾Kcnq1ot1對糖尿病小鼠心臟結構的影響采用HE染色和Masson染色的方法評價各組小鼠的心臟形態學改變和纖維化程度。HE染色結果表明，與對照組相比，糖尿病小鼠左心室心肌細胞肥大，排列紊亂；干擾Kcnq1ot1后，心肌細胞肥大減輕(Fig 3A)。Masson染色結果表明，糖尿病小鼠左心室膠原沉積增多，心肌纖維化加重；干擾Kcnq1ot1后，膠原沉積減少，纖維化改善(Fig 3B)。

Fig 3 Cardiac structure attenuated by silencing Kcnq1ot1 in diabetic mice(n=5)

2.4 干擾Kcnq1ot1對糖尿病小鼠心臟膠原的影響為進一步探討lncRNA Kcnq1ot1對糖尿病小鼠心肌纖維化的調控作用，應用Western blot方法檢測心臟膠原的表達情況。實驗結果表明，DM組小鼠心臟組織collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表達水平明顯升高，DM+Kcnq1ot1-shRNA組膠原表達減少(Fig 4)。上述結果說明，干擾Kcnq1ot1可減少糖尿病小鼠心肌膠原沉積。

Fig 4 Cardiac collagen deposition attenuated by silencing Kcnq1ot1 in diabetic

2.5 干擾Kcnq1ot1對糖尿病小鼠心臟TGF-β1/Smads通路的影響我們進一步檢測纖維化相關的TGF-βl/Smads信號轉導通路的表達情況。結果表明，與對照組相比，DM組小鼠心臟組織TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表達水平明顯升高，DM+Kcnq1ot1-shRNA組上述蛋白表達顯著減少(Fig 5)。這說明干擾Kcnq1ot1可抑制糖尿病小鼠TGF-βl/Smads信號轉導通路的激活，減少心肌膠原沉積。

Fig 5 TGF-β1/Smads pathway in cardiac tissues of diabetic mice attenuated by silencing

2.6 干擾Kcnq1ot1對糖尿病小鼠心臟焦亡的影響為研究Kcnq1ot1對糖尿病小鼠心肌焦亡的影響，采用免疫組化、qRT-PCR和Western blot方法檢測各組小鼠心臟組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β和GSDMD-N的表達水平。免疫組化分析表明，與對照組相比，DM組小鼠心臟組織NLRP3、caspase-1和IL-1β表達提高，DM+Kcnq1ot1-shRNA組NLRP3、caspase-1和IL-1β表達減少(Fig 6A)。同時，各組NLRP3、caspase-1和IL-1β的mRNA和蛋白表達水平也表現為相似的趨勢(Fig 6B-E)。此外，糖尿病小鼠心臟組織GSDMD-N的蛋白表達明顯增多，然而抑制Kcnq1ot1后，其表達下調(Fig 6A、E)。這些結果表明，干擾Kcnq1ot1可抑制糖尿病小鼠心臟焦亡的激活。

Fig 6 Kcnq1ot1 involved in regulation of pyroptosis in vivo

3 討論

DCM是DM的一種慢性進展性的心血管并發癥，主要是由于DM引起心肌纖維化、心臟結構改變、舒張功能異常，進而引發收縮功能障礙[10]。LncRNA能夠在表觀遺傳學、轉錄及轉錄后水平調控多種疾病。Kcnq1ot1是一種lncRNA，能夠調控包括心臟疾病在內的多種疾病，然而Kcnq1ot1在DCM的表達及調控機制尚不清楚。本研究發現，Kcnq1ot1在STZ誘導的C57BL/6小鼠左心室組織中表達明顯增多。DM小鼠體內干擾Kcnq1ot1后能夠改善心臟功能并減輕心肌纖維化。因此，本實驗闡明了Kcnq1ot1在DCM中的關鍵作用，可能作為DCM早期診斷的生物學標志物，揭示了lncRNA可以作為DCM的治療靶點。

隨著對糖尿病及其并發癥研究的不斷進展，對DCM的研究已經深入到基因水平。目前已經發現多種ncRNA能夠調控DCM的發生發展，如miRNA、lncRNA和circRNA等[11]。其中，lncRNA可以在DCM病理過程中通過不同機制調節基因的表達。例如，lncRNA H19在DCM中下調，可通過調控miR-675和VDAC1影響細胞凋亡[12]。LncRNA MIAT在高糖處理的心肌細胞和STZ誘導的糖尿病小鼠中表達上調，可以靶向結合miR-22-3p調控DAPK2的表達[13]。LncRNA Kcnq1ot1是一種非編碼RNA，參與調控多個目的基因的轉錄以促進正常的生長和發育。以往的研究表明，Kcnq1ot1與多種疾病相關，包括長QT綜合征、白內障、腫瘤和心肌缺血/再灌注損傷[14-16]。然而，Kcnq1ot1和DM及其并發癥之間的關系鮮有報道。在本研究中，我們的結果表明lncRNA Kcnq1ot1在STZ誘導的DM小鼠的心臟組織中表達明顯增多。抑制Kcnq1ot1能夠明顯抑制caspase-1的表達。本研究闡明了Kcnq1ot1在DCM模型中的差異性表達及作用。

以往的研究已經表明，焦亡參與DCM的發生和進展。高糖環境能夠激活細胞的ROS，激活NLRP3炎癥小體，促進caspase-1的剪切，從而加速IL-1β和IL-18的釋放。caspase-1是焦亡過程中的關鍵因子，能夠調控炎癥細胞因子的成熟[17]。在本研究中，我們發現干擾Kcnq1ot1后，caspase-1和其下游的炎癥因子IL-1β被顯著抑制。值得強調的是，焦亡與炎癥密不可分，而炎癥是很多病理過程的共同機制和中心環節，是多種疾病的發病基礎。糖尿病患者長期處于慢性炎癥狀態，炎癥反應也是DCM發生和進展的關鍵因素。多項研究表明，IL-1β與TGF-β1/Smads通路介導的心肌纖維化密切相關[18]。本研究闡明了干擾Kcnq1ot1可以通過抑制炎癥因子從而減少膠原沉積，改善心肌纖維化。

綜上所述，我們首次發現Kcnq1ot1在體內DCM模型中表達增多，下調Kcnq1ot1通過NLRP3/caspase-1/TGF-β1通路改善心肌焦亡和纖維化。我們的研究闡明了Kcnq1ot1在DCM中的表達及功能，并提出了一種基于非編碼RNA調控的治療DCM的新方法。