抑郁合并失眠對大鼠HPA軸及下丘腦中氨基酸類和單胺類神經遞質的影響

李春艷，王宇紅,王 華， 趙洪慶，李姿蓉，楊 蕙，黃會珍

(湖南中醫藥大學 1.科技創新中心，2.第一附屬醫院,湖南 長沙 410208)

抑郁癥是一種常見的精神疾病，慢性應激可能是其病因，研究表明大部分抑郁癥患者伴有睡眠障礙[1]。睡眠障礙在慢性應激下導致失眠，同時，應激狀態下的機體免疫功能下降，引發炎癥反應，從而導致組織損傷。因此，失眠又是抑郁癥的危險因素。此外，應激激活下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)，HPA軸亢進導致谷氨酸(glutamate，Glu)和γ-氨基丁酸(gamma-amino butyric acid，GABA)比例失調。HPA軸同時受多種神經遞質和神經肽的調節，包括5-羥色胺(hydroxytryptamine,5-HT)能、去甲腎上腺素(Noradrenaline,NE)能和多巴胺(dopamine,DA)能等，HPA軸失調被認為與抑郁癥的發生發展密切相關。另一方面，失眠與HPA軸的功能障礙密切相關，HPA軸的激活使促腎上腺皮質激素(adrenocorticotrophic hormone，ACTH)和皮質酮(corticosterone，CORT)的濃度增加，產生覺醒效應。下丘腦同時作為HPA軸負反饋調節的首要環節及內分泌系統和神經免疫系統的中心，當機體長期處于應激狀態，導致HPA軸亢進，啟動激素級聯反應，引起系列分子的變化及腦部損傷，可能是抑郁失眠的發病機制。綜上，本實驗采用慢性不可預測輕度應激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)聯合睡眠剝奪(sleep deprivation，SD)建立大鼠抑郁癥失眠模型，探索大鼠抑郁失眠的發病機制，為抑郁癥失眠的機理闡明提供更多的數據。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級SD雄性大鼠84只，體質量(180-200) g(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司)，質量合格證號：1107271911001684，實驗動物許可證號：SCXK(湘)2016-0002。實驗單位為湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心SPF級動物房，設施使用許可證編號：SYXK(湘)2015-0003。

1.2 試劑CORT,ACTH,CRH酶聯免疫試劑盒(均為20191205，JINGTIAN)；去甲腎上腺素，多巴胺鹽酸鹽，5-羥色胺鹽酸鹽標準品(B24713，B25300，B21833，上海源葉生物科技有限公司)；TRIzol(152105，美國ambion公司)；cDNA Synthesis Kit(00760266，Thermo Scientific)；SYBR qPCR SuperMix Plus(0516511，Novoprotein)；GABAAR，GABABR，GAD67，GAPDH兔抗大鼠多克隆抗體，羊抗兔二抗(bs-4112R，bs-1293R，bs-1302R，bs-2188R，bs-0295G，北京bioss公司)；兔抗CREB多克隆抗體(ab32515，英國Abcam公司)；兔抗CaMKⅡ多克隆抗體(3362S，cell signaling technology)；ECL試劑盒(Multi Sciences)。

1.3 主要儀器MK3型酶標儀(美國Thermo Scientific公司)，湖南中醫藥大學科技創新中心自制睡眠剝奪臺，超微量核酸蛋白濃度測定儀(英國Bio Drop公司)，ECO型PCR擴增儀(美國illumina公司)，1260型高效液相色譜儀(美國Aglient公司)，ECD電化學檢測器(荷蘭Antec公司)，Chemi Doc XRS+Imager型化學發光系統(美國BIO-RAD公司)。

1.4 分組和造模分組,分為7組：慢性不可預測輕度應激組(CUMS)、72 h睡眠剝奪組(72 h SD)、慢性不可預測輕度應激+72 h睡眠剝奪組(CUMS+72 h SD)、21 d睡眠剝奪組(21 d SD)、慢性不可預測輕度應激+21 d睡眠剝奪組(CUMS+21 d SD)、空白對照組和環境對照組。

造模,適應性5 d后，d 6開始為造模d 1，造模前14 dCUMS、CUMS+72 h SD、CUMS+21 d SD 3組均進行CUMS造模。造模d 15-35開始SD造模，其中21 d SD組每天15:00至隔天9:00進行18 h SD[2]，連續21 d；72 h SD組于造模最后3 d進行連續72 h SD[3]；兩個復合模型組在進行失眠造模期間均不間斷抑郁造模。分別于抑郁造模14 d后和復合造模結束后對各組大鼠進行行為學檢測。CUMS具體方法為：每只大鼠孤籠飼養和應激造模，包括禁食、4 ℃冰水環境、傾籠、噪音、潮濕墊料、晝夜顛倒、足底電擊、禁水、夾尾。每天一種刺激，每種刺激3 d內不重復。

1.5 行為學實驗開野實驗：將大鼠置于敞箱中,適應30 s后記錄大鼠在4 min內的活動情況。每當其爬行過1格或上肢攀附在箱壁上1次,則加1分,最后以總分進行數據統計。

強迫游泳實驗：將大鼠放入水缸中適應30 s后測試4 min內大鼠的不動時間。四肢均保持不動或稍微運動，即記為游泳不動時間，以此來評價每組大鼠的絕望狀態。

糖水偏好實驗：禁食禁水24 h后進行，計算1 h內大鼠蔗糖水消耗量，根據每組大鼠的糖水平均消耗率來判斷其快感缺失程度。

1.6 酶聯免疫分析測定血清和下丘腦中HPA軸指標和氨基酸類神經遞含量使用大鼠CRH、ACTH、CORT、Glu和GABA的ELISA試劑盒(均為20191205，JINGTIAN)，分別測定血清中CRH、ACTH、CORT和下丘腦中Glu、GABA的含量。

1.7 HPLC-ECD法測定單胺類神經遞質NE、DA、5-HT含量對冷凍保存的下丘腦用0.01 mol·L-1HClO4溶液進行前處理，勻漿后取上清備用。色譜條件：Quattro 4 C18色譜柱規格：柱長150 mm，直徑為2.1 mm，填充顆粒為3 μm；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：35 ℃；樣量：20 μL；流動相：單水磷酸二氫鈉90 mmol·L-1、單水檸檬酸50 mmol·L-1、辛烷磺酸鈉1.7 mmol·L-1、EDTA50 μmol·L-1，4種物質混合液 ∶甲醇=90 ∶10。將NE、DA、5-HT對照品配置成標準曲線。

1.8 HE染色觀察下丘腦組織病理狀態將下丘腦組織進行石蠟包埋，制成石蠟切片，然后脫蠟和水化。蘇木精染色,自來水清洗,置于鹽酸乙醇分化,并用純水沖洗。乙醇伊紅染色,純水沖洗。之后脫水,再分別放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明。將切片取出,在組織上滴加中性樹脂，蓋上蓋玻片，拍照。

1.9 Western blot檢測下丘腦中GABA相關蛋白表達提取下丘腦總蛋白，然后進行電泳，常規轉膜，5%脫脂奶粉封閉1.5-2.0 h，常規清洗，分別加入1 ∶800稀釋的GABAAR、GABABR、GAD67抗體和1 ∶1 000稀釋的CaMKⅡ、CREB、GAPDH抗體4 ℃過夜；加入1 ∶2 000稀釋的二抗在室溫下孵育1 h，洗滌，滴加ECL發光液成像。

1.10 RT-qPCR法檢測下丘腦中GABA信號相關分子基因表達用TRIzol試劑提下丘腦組織的總RNA。測定RNA濃度和純度，然后按照Thermo試劑盒進行逆轉錄。測定目的基因和內參β-actin的PCR產物Cq值。完成實驗后,采用2-ΔΔCq法分析數據。使用Primer Premier 6.0軟件自行設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物具體信息見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for qPCR

2 結果

2.1 大鼠日常行為觀察和體質量結果日常行為：空白對照組大鼠在落水1-2次后便能較快找到小平臺，適應新環境的能力較強；經過CUMS造模的各組大鼠落水4-5次后才能站在小平臺上，且短暫停歇后會再次落水，適應新環境能力較差，可知慢性應激能夠削弱動物的記憶認知能力。

體質量增長率：與空白對照比較，各模型組大鼠體質量增長率下降(P<0.05)，尤以CUMS+21 d SD組下降明顯；與CUMS組比較，CUMS+72 h組和CUMS+21 d SD組大鼠在造模后期體質量增長率下降；在造模后期，與CUMS+72 h組相比，CUMS+21 d SD組大鼠的體質量增長率是下降的(P<0.01),見Fig 1。

Fig 1 Body weight growth rate of

2.2 行為學實驗結果

2.2.1開野實驗 CUMS 14 d后：與空白組對照組相比，CUMS造模兩周后，除單純失眠組，各模型組大鼠均表現出了自主活動降低的趨勢(P<0.01)，說明大鼠已出現抑郁樣情緒。

復合造模后：造模結束后，兩個復合模型組大鼠自主活動次數和糞便粒數與空白對照組相比差異有顯著性(P<0.05)，復合造模大鼠比純抑郁大鼠表現出更低的自主活動,見Tab 2。

Tab 2 Results of open field experiment after 14 days of CUMS modeling and end of composite model

2.2.2強迫游泳實驗 CUMS 14 d后：與空白對照組相比較，經過CUMS造模的模型組大鼠不動時間顯著增加(P<0.05)。

復合造模后：與空白組相比，各模型組動物不動時間增加(P<0.05)；兩個復合模型組不動時間變化雖差異無統計學意義，但CUMS+21 d SD組大鼠不動時間較長，說明長期慢性的應激失眠造模更能增加大鼠的絕望程度；與CUMS組相比，CUMS+21 d SD組大鼠不動時間有所增加,見Tab 3。

Tab 3 Results of forced swimming experiment after 14 days of CUMS modeling and end of composite

2.2.3糖水偏好實驗 CUMS 14 d后：與空白對照組相比，經過14 d的CUMS，各造模組的平均糖水消耗率下降(P<0.01)；表明經過一段時間的應激后，大鼠的快感有一定程度的缺失，表現出抑郁樣情緒。

復合造模后：造模結束后，與空白對照組相比，各模型組糖水消耗率均下降(P<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+21 d SD組大鼠糖水消耗率有所下降，但差異無統計學意義；與CUMS+72 h SD組相比，CUMS+21 d SD組大鼠的糖水消耗率下降(P<0.05),見Tab 4。

Tab 4 Experimental results of sugar water consumption in CUMS modeling for 14 days and composite

2.3 復合造模后戊巴比妥鈉翻正實驗與空白對照組相比，各模型組大鼠睡眠潛伏期增長(P<0.05)，睡眠時長縮短(P<0.01)；與CUMS組相比，CUMS+21 d SD組大鼠的睡眠潛伏較長，睡眠時長變短，CUMS+72 h SD組大鼠則差異無顯著性,見Tab 5。

Tab 5 Results of correction experiment at the end

2.4 ELISA測定HPA軸各指標和氨基酸類神經遞質含量

2.4.1血清中HPA軸各指標含量 與空白對照組相比，各模型組大鼠血清中各激素含量均升高(P<0.05)，CUMS+21 d SD組增加趨勢最為明顯；與CUMS組或CUMS+72 h SD組相比，CUMS+21 d SD組大鼠3個指標含量均增加(P<0.05)，可推測長期睡眠不足更易加重抑郁狀態下的HPA軸亢進,見Tab 6。

Tab 6 Changes in contents of CRH,ACTH,CORT in serum and hypothalamus of n=6; hypothalamus n=3)

2.4.2下丘腦中HPA軸各指標含量 與空白對照組相比，各模型組大鼠下丘腦中CRH、ACTH、CORT含量升高(P<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+21 d SD組CRH含量均增加(P<0.01)，ACTH、CORT含量的增加雖無統計學意義，但趨勢也較明顯；與CUMS+72 h SD組比較，CUMS+21 d SD組HPA軸各指標含量均增加,見Tab 6。

2.4.3下丘腦中氨基酸類神經遞質含量 與空白對照組相比，各模型組大鼠下丘腦Glu含量上升，GABA含量下降(P<0.05)，其中兩個復合模型組和21 d SD組的Glu/GABA失調(P<0.01)；與CUMS組或CUMS+72 h SD組相比，CUMS+21 d SD組大鼠Glu和GABA含量變化明顯(P<0.05)，二者比例失調(P<0.05),見Tab 7。

Tab 7 Changes of Glu and GABA content in hypothalamus

2.5 HPLC-ECD法測定單胺類神經遞質含量

下丘腦中NE、DA、5-HT含量，與空白對照組相比，各模型組大鼠下丘腦中3種單胺遞質含量均下降(P<0.05)；與CUMS組或CUMS+72 h SD組比較，CUMS+21 d SD組3種單胺遞質的含量均降低(P<0.05),見Tab 8。HPLC-ECD檢測3種單胺遞質示例色譜圖,見Fig 2。

Fig 2 Example chromatograms of different samples detected by HPLC-ECD

Tab 8 Changes of monoamine transmitter contents in

2.6 HE染色觀察下丘腦組織病理狀態空白對照組大鼠下丘腦細胞大小均勻，排列有序，細胞無空泡樣現象；CUMS+72 h SD和CUMS+21 d SD組下丘腦神經元細胞形態結構損傷嚴重，尤以后者更為明顯，細胞排列紊亂、間隙變大，胞體增大，空泡樣性狀明顯，細胞形態病變，出現神經元丟失現象；對比72 h SD和21 d SD兩組細胞，后者的病變程度更深,見Fig 3。

Fig 3 HE staining results of rat hypothalamus(×200)

2.7 Western blot檢測下丘腦中GABA相關蛋白表達與空白對照組相比，各模型組大鼠下丘腦中GAD67、GABAAR、GABABR、CaMKⅡ、CREB蛋白灰度值均下降(P<0.05)；與CUMS組比較，CUMS+21 d SD組各分子蛋白含量降低(P<0.01)，而CUMS+72 h SD組則只有GAD67和CaMKⅡ的變化差異有顯著性；與CUMS+72 h SD組比較，CUMS+21 d SD組大鼠下丘腦中GABA相關蛋白表達均降低(P<0.01或P<0.05),見Fig 4,5。

Fig 4 The gray value expression of GABA signal molecule protein in hypothalamus of

Fig 5 Expression of GABA signaling related molecules in hypothalamus of rats

2.8 RT-qPCR檢測下丘腦中GABA相關基因表達與空白對照組相比，各模型組大鼠下丘腦中GAD67、GABAAR、GABABR、CaMKⅡ、CREB基因表達均下降(P<0.05)；與CUMS組或CUMS+72 h SD組比較，CUMS+21 d SD組大鼠下丘腦中GABA相關分子基因表達量均下降(P<0.01),見Tab 9。

Tab 9 The gene expression of GABA signaling related molecules in hypothalamus of

3 討論

目前，抑郁癥中最常用的造模方法是慢性不可預測輕度應激，失眠的造模方法主要有化學試劑刺激法和物理應激法。化學試劑法易產生假陽性結果，同時對操作人員技術要求高[4]。物理應激法[5-6]包括強迫運動法、足休克法、輕柔刺激法、慢性束縛法和水平臺法。對比研究，本實驗選擇水平臺法，其共經歷了單平臺、多平臺及改良多平臺3個階段，其中改良多平臺睡眠剝奪法(modified multiple platform method，MMPM)應用更為普遍[7]。利用大鼠厭畏水的特性，在平臺的周圍注滿水，水面距平臺約1.0 cm。大鼠在平臺上可以自行進食飲水，若其睡眠，則由于肌張力松弛而落入水中，需重新振作精神爬上平臺，如此反復達到選擇性剝奪快動眼睡眠(rapid eye movement sleep，REMS)的效果。抑郁癥狀態下的睡眠質量變差最顯著表現在REMS潛伏期縮短、密度增加，因此采用REMS剝奪更貼近人類患病特點。一般采用72 h的短期快速睡眠剝奪，或者每天剝奪10-18 h連續2-3周的長期慢性睡眠剝奪[8-9]。結合本研究目的選擇對比觀察72 h快速睡眠剝奪，和每天造模18 h連續3周慢性睡眠剝奪這兩種方式，最終確定最佳造模方式。因可使動物受到制動、浸水等刺激，設置環境對照組來排除干擾。

實驗通過體質量增長率、攝食量、日常大鼠行為觀察發現，CUMS+21 d SD組大鼠的體重增長率最低，攝食量減少程度最大。而通過糖水偏好、開野實驗和強迫游泳行為學測試，發現各模型組大鼠快感顯著缺失、自主活動下降及求生欲降低，其中以復合模型CUMS+21 d SD組明顯。表明長時間失眠可使大鼠萎靡不振。此外，與空白組對比，戊巴比妥鈉實驗發現CUMS組大鼠睡眠潛伏期增長，睡眠時長顯著縮短，表明抑郁癥本身具有誘發失眠的傾向。但復合模型較純抑郁組睡眠潛伏期更長，睡眠時長更短，同時慢性睡眠剝奪比快速睡眠剝奪效果更佳。通過環境對照組對比，發現周圍環境的制動、浸水刺激對大鼠影響較小，基本可忽略。兩個復合模型組較貼切地復制了抑郁癥失眠的臨床表征，CUMS+21 d SD組各方面數據優于CUMS+72 h SD組，更符合人類失眠發病緩慢、病程長等特點。因此，抑郁失眠模型可通過慢性輕度應激聯合21 d睡眠剝奪來復制。

實驗使用ELISA檢測發現，抑郁癥失眠大鼠血清和下丘腦中CRH、ACTH和CORT含量上升，下丘腦中Glu/GABA比例上升，大腦興奮性毒性增加，GABA信號分子表達下降。而通過Western blot和RT-qPCR進一步驗證了此想法，對于抑郁癥失眠大鼠，其下丘腦中GABA相關分子GABAAR、GABABR、GAD67、CaMKⅡ、CREB的蛋白及基因表達顯著下降，表明GABA相關分子表達被抑制，導致樹突障礙和神經元存活率下降。HPLC-ECD發現下丘腦中單胺類神經遞質NE、DA和5-HT顯著減少。進一步通過HE染色觀察下丘腦，發現神經元細胞形態結構損傷嚴重，細胞排列紊亂、間隙變大，胞體增大，空泡樣性狀顯著，細胞形態病變，出現神經元丟失現象，表明抑郁癥失眠大鼠下丘腦受損。總而言之，本實驗研究發現，通過慢性應激聯合睡眠剝奪可導致大鼠HPA軸亢進，使CRH、ACTH和CORT表達上升，下丘腦中單胺遞質及氨基酸類神經遞質表達發生改變，下丘腦神經元和突觸受損，這些改變可能是抑郁合并失眠的發病機制。

抑郁與失眠均涉及神經內分泌的變化，下丘腦作為HPA軸負反饋調節的首要環節和神經內分泌中心，啟動激素分泌，發揮其對HPA軸的調控作用[10]。GABA通過抑制興奮性神經元，阻斷Glu的興奮毒性，二者比例失調被認為是抑郁癥和失眠的重要因素。Glu增多導致的興奮毒性可誘導抑郁樣行為，而臨床上抗失眠藥物多是模擬GABA作用，增強受體與GABA的親和力和GABA能神經元的傳遞作用，產生鎮靜催眠、抗焦慮等作用[11]。GABA能神經元廣泛分布于下丘腦視交叉上核區域[12]，GAD67是其直接標記物[13]，腦內主要分布的是GABAA和GABAB受體。GABABR介導未成熟神經元興奮，進而激活CaMKII，磷酸化CREB結合位點，從而促進樹突成熟與神經元存活[14]。在應激狀態下，HPA軸亢進，ACTH和GC分泌過度，GC進一步誘導Glu釋放和興奮性傳遞異常增強，導致Glu/GABA比例增大，GABA相關信號被抑制，引起神經毒性，損傷下丘腦，反過來加重抑郁失眠的發生發展[15]。單胺遞質假說是抑郁癥發病機制中最為經典的一種，同時與失眠的發生發展密切相關，對于睡眠-覺醒節律的調節具有重要意義，Menon等[16]使用微透析技術證明單胺遞質及其代謝產物在不同時長的睡眠剝奪期間發揮著重要作用，同時HPA軸失調可導致單胺遞質的改變[17]。

本實驗通過建立抑郁失眠大鼠模型，研究其對HPA軸和下丘腦中氨基酸類和單胺類神經遞質的影響，進一步探討其發病機制。實驗發現，抑郁合并失眠大鼠中存在HPA軸功能障礙，GABA/Glu比例失調，單胺類神經遞質減少，同時結合他人研究，進一步推測HPA軸失調導致氨基酸類和單胺類神經遞質的改變，可能是抑郁合并失眠的發病機制。另外，本實驗因時間技術有限，未對抑郁癥失眠大鼠進行睡眠監測，其造模期間腦電波的活動特征能反應出大鼠的睡眠狀態，這值得下一步深入探討。