中性粒細胞型哮喘差異表達基因的生物信息學分析及其潛在治療藥物篩選

宋偉華，謝欣辛，秦 瓊，范國榮

(1. 上海交通大學附屬第一人民醫院臨床藥學科，上海 200080;2. 上海市皮膚病醫院藥劑科，上海 200443;3. 蘇州大學附屬第一醫院藥學部，江蘇 蘇州 215006)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種以氣道高反應性為特征的由多種炎癥細胞參與的慢性氣道炎癥性疾病。哮喘具有明顯的異質性，根據患者肺部及氣道組織中不同類型的炎癥細胞，哮喘可分為嗜酸粒細胞型(eosinophilic asthma，EA)、中性粒細胞型(neutrophilic asthma，NA)和混合粒細胞型(mixed granulocytic asthma，MA)[1]。有研究顯示[2]，NA對激素的治療反應性差，臨床癥狀比其它類型的哮喘更難控制，但其具體機制尚未完全明確。因此，深入探討NA的發病機制，尋找新的治療靶點及干預藥物具有重要的臨床意義。

隨著基因芯片技術與高通量技術的發展，運用生物信息學方法對基因芯片數據進行挖掘可以快速有效地篩選出差異基因，近年來，廣泛應用于疾病的致病機制的闡明、藥物治療靶點的篩選[3-5]。本研究從GEO數據庫中篩選出NA的相關差異基因，進而對這些基因進行GO功能富集和KEGG信號通路富集分析，并從PPI網絡中篩選出關鍵基因，采用分子對接技術篩選潛在的先導化合物，為進一步闡明NA的發病機制和尋找新的治療藥物提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 差異基因的篩選基因表達數據來自GEO數據庫中的GSE137268芯片，利用GEO2R在線分析工具對基因表達譜進行分析，篩選出滿足|log(2 Fold Change)|≥1.0且P<0.05的差異表達基因，同時至少一個樣品該基因FPKM≥1(去除表達量低的基因)。其中log 2FC正值為上調基因，log 2FC負值為下調基因。

1.2 PPI網絡構建與關鍵基因篩選將獲得的差異基因上傳至STRING數據庫，物種設定為人類，構建PPI網絡，下載TSV文件，利用 Cytoscape 軟件進行PPI網絡可視化，對構建的PPI網絡進行分析，將節點中心度值(Degree)排在前10位的基因靶點作為關鍵靶點。

1.3 差異基因的GO功能與KEGG信號通路富集分析利用DAVID數據庫對差異基因進行GO(Gene ontology，GO)基因功能注釋分析，包括生物學過程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular function，MF)和細胞組分(Cellular component， CC); 并對差異基因進行KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG) 通路富集分析。選取前10個條目進行分析，以P<0.05作為顯著性基因富集篩選標準。

1.4 分子對接技術篩選先導化合物采用ChemSketch軟件畫出對接化合物的化學結構，將其3D結構能量最小化后保存為MOL格式。將目標基因上傳至PDB數據庫，將基因的3D結構保存為PDB格式，用iGEMDOCK分子對接軟件進行對接，根據對接能量的高低來判斷靶蛋白與化合物的結合程度，能量越低，代表二者的結合程度越高。

2 結果

2.1 NA與健康人群中差異表達基因的篩選從GEO數據庫中的GSE137268芯片獲得了11個NA和15個健康人的誘導痰基因表達數據，通過GEO2R對兩組數據進行分析，篩選出滿足|log2FC|≥1.0且P<0.05的差異表達基因，共篩選出147個差異基因，其中上調基因7個，下調基因140個，見Tab 1。

Tab 1 The differential expression genes of NA patients compared with healthy people

2.2 PPI網絡分析及關鍵基因篩選通過STRING數據庫構建了差異基因的PPI網絡，通過Cytoscape軟件將綜合得分大于0.4的相互作用的PPI網絡可視化。如Fig 1所示，該網絡由99節點和326邊構成，節點代表基因靶點，邊代表相互作用。使用Cytoscape 軟件中的“NetworkAnalyzer”插件對該網絡進行分析，根據Degree值排序，排名前10的關鍵基因分別為CXCL8、FPR2、CXCL1、TNFRSF1B、CXCR1、FPR1、CXCR4、CLEC4D、GPR84與CXCR2。

Fig 1 PPI network of differential expression genes

2.3 GO注釋與KEEG通路富集分析通過DAVID數據庫對147個差異基因進行GO與KEGG通路富集分析，結果見Fig 2與Tab 2。GO富集顯示這些基因主要參與炎癥反應、趨化作用、免疫反應等生物過程；在細胞組分中主要影響細胞膜、細胞外泌體、膜錨蛋白等；在分子功能中主要影響受體活性、碳水化合物結合與IL-8受體活性等。KEGG通路富集分析顯示，差異表達基因與細胞因子-細胞因子受體相互作用、環磷酸腺苷信號通路、NOD樣受體、補體與凝血等信號通路有關。

Tab 2 KEGG enrichment analysis of differential expression genes

Fig 2 GO enrichment analysis of differential expression genes

2.4 分子對接結果將SERPINA1、PLAU、C8B、CD55與CXCL8基因與具有抗補體活性的化合物芍藥苷元酮、白藜蘆醇、雷公藤甲素進行分子對接。分子對接結果如Tab 3所示，結果表明芍藥苷元酮與C8B、PLAU、CXCL8結合能力較強，各化合物與補體與凝血通路中的PLAU、C8B靶蛋白結合能力較強，其中芍藥苷元酮與雷公藤甲素與C8B的結合能力最強，其分子對接示意圖如Fig 3、4所示。

Fig 3 Molecular docking diagram of paeoniflorigenone with C8B

Fig 4 Molecular docking diagram of triptolide with C8B

Tab 3 Results of molecular docking

3 討論

NA以肺組織中性粒細胞增多為特點，表現出更嚴重的臨床癥狀，對糖皮質激素治療反應較差，其具體機制尚未完全明確。為了進一步闡明NA的發病機制，本研究通過生物信息學分析方法對GEO數據庫GSE137268芯片中NA患者與健康人群中的誘導痰的表達基因分析，獲得了147個差異基因，其中7個為上調基因，140個為下調基因。對這些差異基因進行了PPI網絡分析、GO功能注釋與KEGG通路富集分析。

PPI網絡分析得到了10個核心基因，根據它們的Degree值確定CXCL8基因最為關鍵。CXCL8作為重要的中性粒細胞趨化因子，趨化與活化中性粒細胞匯集于肺組織，引起肺部炎癥和氣道高反應。近年的研究表明[6]，患者肺泡灌洗液中CXCL8的濃度與中性粒細胞的數量呈正相關，與FVC/FEV1成明顯的負關系。本研究通過生物信息學分析方法進一步證明了CXCL8在NA的致病機制中起關鍵作用。

KEGG富集分析顯示，差異基因受多種信號通路的調節，如細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路、環磷酸腺苷信號通路，NF-κB信號通路，這些通路在以往的研究中被證實參與了哮喘的炎癥過程[7-9]。此外，我們的研究發現補體與凝血信號通路參與了NA的病理過程。補體系統是機體重要的免疫系統，在免疫防御中發揮了關鍵作用。補體系統通過經典、旁路和凝集素途徑激活后，其活化產物C3a與C5a是重要的趨化因子，募集與活化嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等炎癥細胞匯集于肺組織[10]，釋放多種炎癥介質如CXCL8、IL-6、IL-1與TNF-α，從而此起氣道高反應[11-12]。此外，補體激活產物C5a能直接抑制中性粒細胞凋亡，加重氣道炎癥反應[13]。這提示補體系統的激活在NA的發病機制中起了重要作用。采用抗補體藥物抑制補體系統的激活或許可以達到治療NA的目的。

為了進一步驗證抗補體藥物治療NA的可行性，我們選取了文獻報道具有較強補體抑制活性的芍藥苷元酮、白藜蘆醇與雷公藤甲素3個化合物與補體與凝血通路中的4個基因SERPINA1、PLAU、C8B與CD55以及受多條信號通路調節的CXCL8基因進行分子對接[14-16]。分子對接顯示各化合物與上述靶蛋白均具有較好的結合活性，尤以芍藥苷元酮與雷公藤甲素與C8B的結合能力最強。C8B是組成攻膜復合物(membrane attack complex，MAC)的重要成分之一。補體系統異常活化產生的MAC可激活巨噬細胞、中性粒細胞、單核細胞釋放IL-8、IL-1等細胞因子，參與炎癥反應[17]。

雷公藤甲素是傳統中藥雷公藤的主要活性成分之一，具有抗炎和免疫調節等藥理活性。黎雄斌等研究發現雷公藤甲素可以明顯緩解中性粒細胞哮喘小鼠氣道炎癥，但其機制不明確[18]。本研究通過生物信息學分析方法和分子對接技術揭示了雷公藤甲素治療NA的機制可能與其抑制補體系統的過度激活有關。課題組前期在中藥牡丹皮的抗補體活性成分的篩選過程中發現芍藥苷元酮具有很好的抗補體活性[14]。本研究發現芍藥苷元酮與多個NA相關的靶蛋白具有很好的結合活性，其體內藥理作用有待后續研究中進一步驗證。

綜上所述，本研究基于GEO數據庫，運用生物信息學方法分析了NA的差異表達基因，篩選出的關鍵基因及信號通路與NA的致病機制密切相關，進一步通過分子對接技術發現芍藥苷元酮與雷公藤甲素與補體與凝血通路的基因蛋白具有良好的結合活性，可以作為NA的潛在治療藥物。本研究為NA的治療提供了新的思路與方法。