芍藥苷-6′-O苯磺酸酯調節GRK2對CIA大鼠巨噬細胞JAK1/STAT3信號通路的影響

斯 夢，張春梅，姜 玲，魏 偉

(安徽醫科大學臨床藥理研究所、抗炎免疫藥物教育部重點實驗室、抗炎免疫藥物安徽協同創新中心，安徽 合肥 230032)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種全身性、破壞性自身免疫性疾病，以全身免疫功能異常紊亂為特征，局部表現為多關節炎癥，大量免疫細胞浸潤，滑膜增生，血管翳生成，會對肌腱、軟骨和骨骼造成不可逆的損害[1]。增生的滑膜組織中存在大量浸潤的巨噬細胞，這些巨噬細胞與成纖維細胞的相互作用可以促進多種促炎細胞因子的分泌，特別是前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)和白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)等，巨噬細胞分泌的細胞因子在關節炎的發病過程中扮演重要角色[2]。根據表型和分泌的因子，目前巨噬細胞被分為 M1 型和 M2 型巨噬細胞，正常生理情況下M1型與M2型處于動態平衡中。M1 型巨噬細胞通常被視為是促炎型巨噬細胞，產生各種促炎細胞因子和趨化因子，M2 巨噬細胞則被視為是抗炎型巨噬細胞[3]。JAK1/STAT3信號通路的激活可以促進巨噬細胞分泌PGE2、IL-6等炎性因子[4]在許多免疫介導疾病的發病機制中發揮了關鍵作用，而IL-6也可以激活JAK1/STAT3信號通路。G 蛋白偶聯受體激酶2(G protein coupled receptor kinase 2,GRK2)是一種重要的炎癥免疫反應的調節蛋白，GRK2的表達和活性的失衡在RA的發生發展中起著重要作用，課題組以往研究表明，PGE2不斷刺激下，腹腔巨噬細胞中EP4受體過度脫敏, GRK2發生膜轉位，與EP4受體共表達增加，cAMP 和p-CREB表達減少， PGE2-EP4-cAMP-CREB信號通路的異常介導CIA小鼠巨噬細胞向M1型極化，導致炎性細胞因子的產生,增強炎性細胞浸潤和破壞軟骨和骨骼[5]。芍藥苷(paeoniflorin,Pae)已普遍用于治療自身免疫性疾病，但由于Pae的滲透性較差，需要較長時間才能發揮作用,為了改善這一特性，將Pae酯化后，得到了具有較好的脂溶性和生物利用度的化學結構修飾產物CP-25，CP-25在佐劑性關節炎(adjuvant induced arthritis,AA)和膠原性關節炎 (collagen-induced arthritis,CIA)大鼠和小鼠的體內直接發揮改善炎癥的作用，已證實其主要是通過抑制CRK2轉膜，進而影響多種信號通路[6-8]，課題組研究已發現CP-25可降低人外周血單核細胞p-JAK1、p-STAT3的蛋白表達[9]。然而，在巨噬細胞中GRK2與JAK1-STAT3信號的關系及CP-25的調控作用尚不清楚。本研究旨在探討在實驗性關節炎中，IL-6、PGE2影響下的巨噬細胞JAK1/STAT3與GRK2之間是否存在聯系，CP-25是否通過調節GRK2進而發揮抑制巨噬細胞JAK1/STAT3的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 SPF級SD雄性大鼠34只，6周齡，(180-200) g，購自北京維通利華有限責任公司。飼養于安徽醫科大學臨床藥理研究所SPF動物實驗室，給予動物自由飲水與攝食，飼養環境溫度(20-25)℃，濕度40%-70%，光照12 h。

1.1.2試劑 Arthrogen-CIA II 型膠原(20011，美國 chondrex 公司)； 完全弗氏佐劑(F5881,美國 Sigma 公司)；DMEM培養液(12100046，美國 HyClone 公司)；胎牛血清(16000-044，以色列Biolnd公司)；CP-25(安徽醫科大學臨床藥理研究所)；托法替布(HY40354A，美國MCE公司)；PGE2、IL-6( 3632464、500-P73，Peprotech 生物公司)；鼠抗GRK2抗體、PE標記的anti-rat CD206抗體(sc-13143、sc-376108，美國Santa cruz 公司)；兔抗JAK1(ab133666，英國Abcam公司)；p-JAK1、STAT3(AF2012、AF6294，美國Affinity公司)、p-STAT3抗體(9145，美國CST公司)；APC標記的anti-rat CD68抗體、FITC標記的anti-rat CD86抗體(130-103-364、130-109-129，德國Miltenyi 公司)；大鼠PGE2、IL-6 ELISA試劑盒(ml003036、ml064292，上海酶聯生物科技有限公司)。

1.1.3儀器 Infinite M1000 PRO 多功能酶標儀(TECAN公司)；Image Quant熒光及化學熒光及化學發光成像系統(GE公司)；Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡(Leica公司)；Beckman CytoFLEX流式細胞儀(Beckman 公司)； ImageStreamX Mark Ⅱ成像流式細胞儀(Meck Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠CIA模型的建立及給藥分組 SD雄性大鼠適應性飼養1周后，隨機分為正常組，其余大鼠于尾根部及右后跖底部分別皮內注射0.1 mL完全弗氏佐劑與雞Ⅱ型膠原等體積混合、乳化制成的Ⅱ型膠原乳劑，7 d后于尾根部加強注射1次，d 17根據大鼠繼發側足爪腫脹情況選出18只為造模成功的CIA大鼠，隨機將CIA大鼠分為模型組、CP-25(50 mg·kg-1·d-1)組、MTX(0.5 mg·kg-1·3 d-1)組。每組6只，于d 18開始灌胃給藥。給藥共21 d，結束后處死大鼠。

1.2.2大鼠腹腔巨噬細胞的分離與培養 處死大鼠后，向腹腔中注入15 mL生理鹽水，按摩腹部之后靜置3 min，使腹腔巨噬細胞富集，抽出細胞懸液，離心2 500 r·min-1，10 min，之后加入10% 高糖DMEM培養基重懸至6孔板，貼壁3 h后，棄去上清，用無菌的PBS洗滌3遍，貼壁的為純化后的巨噬細胞，加入10% 高糖DMEM培養基繼續培養。

1.2.3大鼠整體指標、胸腺、脾臟指數測定 每3 d評估與記錄大鼠體質量、關節炎指數、足爪腫脹度。關節炎指數按 5 級評分法評價，0級：無紅腫；1級：趾關節紅腫；2級：趾關節和足趾腫脹；3級：踝關節以下的足爪腫脹；4級：包括踝關節在內的全部足爪腫脹。累積四肢的評分，其最大值為16。足爪腫脹度使用足爪腫脹儀每3 d測定3次大鼠繼發側后肢踝關節以下容積，以致炎前后容積差的平均值為腫脹度。稱量每只大鼠的體質量，處死大鼠后，取出并稱重大鼠的脾臟和胸腺，計算脾臟指數(脾臟重量/體質量)和胸腺指數(胸腺重量/體質量)。

1.2.4ELISA法檢測大鼠外周血血清和腹腔巨噬細胞培養上清中IL-6和PGE2 的含量 收集各組大鼠外周血血清和腹腔巨噬細胞培養上清，采用大鼠IL-6、PGE2 ELISA試劑盒檢測IL-6、PGE2水平。

1.2.5流式細胞術檢測大鼠腹腔巨噬細胞的極化情況 取出各組大鼠原代腹腔巨噬細胞均勻鋪于6孔板中，4 h后移去培養液(體外實驗中取出正常雄性大鼠腹腔巨噬細胞均勻鋪于6孔板，4 h后換液，加入IL-6、PGE2刺激劑培養24 h)，加入預冷的PBS，靜置15 min后，輕輕吹打，收集細胞于EP管中。2 500 r·min-1，10 min離心，去除上清液，加入80 μL 的細胞固定液，避光孵育10 min。加入600 μL PBS后2 500 r·min-1，10 min離心，棄去上清。加入80 μL的細胞破膜液，避光孵育10 min。除了空白對照組，其余每個EP管中加入CD68、CD86和CD206抗體，室溫孵育1 h，加入600 μL PBS離心2 500 r·min-1，10 min，去上清，加入150 μL的PBS重懸，過濾網后上機檢測。

1.2.6成像流式細胞儀檢測大鼠腹腔巨噬細胞中p-STAT3的入核情況 同上述1.2.5步驟處理細胞后，加入p-STAT3抗體室溫孵育1 h，加入600 μL PBS離心2 500 r·min-1，10 min，去上清，加入80 μL DAPI染核5 min，隨后加入600 μL PBS離心2 500 r·min-1，10 min，去上清，加入150 μL的PBS重懸，過濾網后上機檢測。

1.2.7激光共聚焦檢測大鼠腹腔巨噬細胞中GRK2與JAK1共定位及GRK2膜轉位情況 取出大鼠腹腔巨噬細胞后均勻鋪在24孔板中，板中放有無菌細胞爬片，培養4 h后，固定封閉處理細胞，孵育JAK1、GRK2抗體4℃過夜，PBS洗3 min×3次，吸干PBS，加入熒光二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗3 min×3 次，加入少量DAPI染核5 min，用PBS洗3 min×3次，挑片，滴上防熒光淬滅劑，將玻片正面倒置放在載玻片上，用指甲油固定住，隨后使用激光共聚焦熒光顯微鏡拍攝。

1.2.8Western blot法檢測大鼠腹腔巨噬細胞中JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3的表達和GRK2的膜表達 分離培養大鼠腹腔巨噬細胞24 h后，收集細胞，提取蛋白。配制10%的SDS-PAGE凝膠，上樣，電泳，轉膜，封閉，孵育JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3、GRK2抗體4 ℃過夜，洗去一抗，孵育二抗37 ℃ 2 h,洗去二抗，隨后采用化學發光成像系統成像。

2 結果

2.1 CP-25對CIA大鼠全身情況的影響課題組前期研究表明，CP-25對小鼠CIA和大鼠AA治療作用有明顯量效關系[10-11]，且在50 mg·kg-1·d-1療效明顯，因此，在本研究中我們給予CIA大鼠CP-25(50 mg·kg-1·d-1)連續21 d進行整體效果觀察實驗。與正常組相比，模型組大鼠體重明顯降低(P<0.05)，與模型組相比，CP-25與MTX給藥組大鼠體重明顯升高(P<0.05)(Fig 1A)。造模后大鼠關節炎指數逐步上升，于d 27達到高峰；與模型組相比，從d 30開始，CP-25、MTX組大鼠關節炎指數明顯降低(P<0.01)(Fig 1B)。造模后，除正常組外，各組大鼠足爪腫脹度逐步上升，于d 27達到高峰；與正常組相比，模型組大鼠足爪腫脹度明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，CP-25、MTX組大鼠足爪腫脹度降低(P<0.05)(Fig 1C)；與正常組相比，模型組大鼠胸腺、脾臟明顯腫大，指數升高(P<0.05)，與模型組相比，CP-25、MTX組胸腺、脾臟指數降低(P<0.05)(Fig 1D)。上述結果進一步提示，CP-25對CIA大鼠有明顯治療效果。

Fig 1 Global data and organ index of CIA rats n=6)

2.2 CP-25對CIA大鼠外周血血清和腹腔巨噬細胞上清中IL-6和PGE2含量的影響與正常組相比，模型組大鼠外周血血清和腹腔巨噬細胞上清中IL-6、PGE2含量明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，CP-25組明顯降低腹腔巨噬細胞上清中IL-6、PGE2含量及外周血血清中PGE2含量(P<0.05)。MTX組明顯降低外周血血清和腹腔巨噬細胞上清中IL-6、PGE2含量(P<0.01)(Fig 2)。

Fig 2 Levels of IL-6 and PGE2 measured by ELISA in peripheral blood serum and cell supernatant ( n=6)

2.3 CP-25影響CIA大鼠腹腔巨噬細胞的極化情況炎癥情況下，巨噬細胞向M1型極化，為了驗證CP-25是否通過減少M1型巨噬細胞，進而緩解炎癥，因此采用流式細胞術檢測CD86/CD206來反映巨噬細胞極化情況。與正常組相比，模型組大鼠腹腔巨噬細胞中CD86/CD206明顯增多(P<0.05)，與模型組相比，CP-25、MTX組CD86/CD206明顯降低(P<0.01)(Fig 3)，提示CP-25、MTX可使模型組巨噬細胞向M2型極化。

Fig 3 The polarization of peritoneal macrophages in CIA model determined by flow cytometry n=6)

2.4 CP-25對CIA鼠腹腔巨噬細胞中JAK1/STAT3信號通路及GRK2表達的影響進一步探討影響巨噬細胞功能異常的相關機制，采用Western blot法檢測大鼠腹腔巨噬細胞中JAK1/STAT3信號通路上蛋白的變化。與正常組相比，模型組大鼠腹腔巨噬細胞p-JAK1、p-STAT3表達明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，CP-25組p-JAK1、p-STAT3表達明顯降低(P<0.05)(Fig 4A)。通過激光共聚焦顯微鏡觀察了GRK2在腹腔巨噬細胞的表達及GRK2與JAK1之間共定位情況。與正常組相比，模型組大鼠腹腔巨噬細胞GRK2發生明顯膜轉位。與模型組相比，CP-25組GRK2膜轉位情況減少(Fig 4B)。與正常組相比，模型組大鼠腹腔巨噬細胞中GRK2與JAK1共定位結合率明顯升高(P<0.01)、GRK2明顯向胞膜轉移。與模型組相比，CP-25組GRK2與JAK1共定位結合率明顯降低(P<0.01)(Fig 5)。通過成像流式細胞術檢測大鼠腹腔巨噬細胞中p-STAT3入核情況，與正常組相比，模型組大鼠腹腔巨噬細胞中p-STAT3入核率明顯升高(P<0.01)，與模型組相比，CP-25組p-STAT3入核率明顯降低(P<0.01)(Fig 6)。提示GRK2發生膜轉位，降低對JAK1/STAT3信號通路的抑制作用，CP-25減少了GRK2膜轉位，恢復GRK2對JAK1/STAT3信號通路的抑制作用。

Fig 4 Effect of CP-25 on p-JAK1, p-STAT3 and membrane GRK2 expression of peritoneal macrophages in CIA model n=6)

Fig 5 The colocalization rate about GRK2 with JAK1 of peritoneal macrophages in CIA model determined by laser confocal scanning microscope

Fig 6 The p-STAT3 nuclear translocation of peritoneal macrophages in CIA model determined by Imaging flow cytometry

2.5 CP-25在體外對大鼠腹腔巨噬細胞極化情況的影響基于上述整體實驗結果，發現炎癥情況下，IL-6、PGE2明顯升高，JAK1/STAT3信號通路被激活，GRK2發生膜轉位，因此將IL-6(100 μg·L-1)、PGE2(10 μmol·L-1)刺激腹腔巨噬細胞24 h，采用CP-25(100 nmol·L-1、1 μmol·L-1、10 μmol·L-1)和JAK抑制劑托法替布(10 μmol·L-1)為給藥組，給藥24 h,進行體外實驗。流式細胞術檢測CD86/CD206的比例，與Control組相比，IL-6+PGE2組CD86/CD206明顯升高(P<0.01)。與IL-6+PGE2組相比，CP-25(10 μmol·L-1)和托法替布(10 μmol·L-1)組CD86/CD206明顯降低(P<0.01)(Fig 7)，提示CP-25(10 μmol·L-1)和托法替布(10 μmol·L-1)可使IL-6聯合PGE2刺激后的巨噬細胞向M2型極化。

Fig 7 Effect of CP-25 on polarization of peritoneal

2.6 CP-25在體外對大鼠腹腔巨噬細胞中JAK1/STAT3信號通路及GRK2表達的影響激光共聚焦結果顯示，與Control組相比，IL-6+PGE2組大鼠腹腔巨噬細胞中GRK2與JAK1共定位結合率明顯降低(P<0.01)。與IL-6+PGE2組相比，CP-25(10 μmol·L-1)和托法替布(10 μmol·L-1)組GRK2與JAK1共定位結合率明顯升高(P<0.01)(Fig 8)。提示IL-6聯合PGE2刺激后，巨噬細胞中GRK2發生膜轉位，與JAK1之間相互作用減少。CP-25(10 μmol·L-1)和托法替布(10 μmol·L-1)可抑制IL-6聯合PGE2刺激后的巨噬細胞中GRK2發生膜轉位，增加與JAK1之間的相互作用。Western blot結果顯示，與Control組相比，IL-6+PGE2組p-JAK1、p-STAT3的表達明顯升高(P<0.01)，GRK2的膜表達明顯升高(P<0.01)，胞質表達明顯降低(P<0.05)，與IL-6+PGE2組相比，CP-25(10 μmol·L-1)和托法替布(10 μmol·L-1)組p-JAK1、p-STAT3表達明顯降低(P<0.01)，而GRK2 的膜表達明顯降低(P<0.01)，胞質表達明顯升高(P<0.01)(Fig 9)。提示IL-6聯合PGE2刺激后，能明顯增加GRK2發生膜轉位，降低GRK2對JAK1/STAT3信號通路的抑制作用，而激活巨噬細胞上的JAK1/STAT3信號通路。CP-25(10 μmol·L-1)可顯著抑制IL-6聯合PGE2刺激后的巨噬細胞中GRK2的膜轉位。成像流式細胞術結果，與Control組相比，IL-6+PGE2組大鼠腹腔巨噬細胞中p-STAT3入核率明顯升高(P<0.01)。與IL-6+PGE2組相比，CP-25(10 μmol·L-1)和托法替布(10 μmol·L-1)組p-STAT3入核率明顯降低(P<0.01)(Fig 10)。由上述結果可知，IL-6聯合PGE2刺激后，能明顯增加GRK2發生膜轉位，降低GRK2對JAK1/STAT3信號通路的抑制作用，激活了巨噬細胞上的JAK1/STAT3信號通路。而CP-25(10 μmol·L-1)通過減少GRK2膜轉位，發揮對JAK1/STAT3的抑制作用。

Fig 8 The colocalization rate about GRK2 with JAK1 of peritoneal macrophage in vitro experiments determined by laser confocal scanning

Fig 9 Effect of CP-25 on p-JAK1, p-STAT3 and membrane GRK2 expression of peritoneal macrophage in vitro

Fig 10 The p-STAT3 nuclear translocation of peritoneal macrophage in vitro experiments determined by Imaging flow cytometry

3 討論

目前，已有多項研究表明，CP-25具有免疫調節和抗炎作用，可明顯改善AA和CIA大小鼠炎癥情況，緩解足爪關節腫脹、滑膜增生、骨侵蝕等，已證實其主要是通過抑制CRK2轉膜，進而影響多種信號通路，調節滑膜和免疫細胞的異常功能，如通過影響PGE2-EP4-cAMP調節成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)的增殖和小鼠腹腔巨噬細胞的極化[5，12]。

有大量研究表明JAK/STAT信號通路在RA滑膜組織中明顯被激活，STAT3可能在炎癥性關節炎中發揮重要作用，已證實其激活與發生滑膜增生、慢性炎癥和骨損傷等關節病理相關[13-15]。目前，已有JAK抑制劑用于RA的治療如托法替布，然而該類藥物價格昂貴，不良反應多，特別是增加了嚴重感染的風險。因此，通過對JAK1/STAT3信號通路相應調節的研究，使CP-25從分子機制上成為治療RA的有效藥物，增加臨床患者用藥選擇，極具臨床價值。但CP-25是否通過抑制JAK/STAT信號通路治療關節炎，且其作用的具體機制尚不清楚。

在RA患者的滑膜液和關節組織中浸潤著大量巨噬細胞，這些巨噬細胞處于M1/M2型比例失衡情況，釋放出大量促炎細胞因子如PGE2、IL-6，加重炎癥和關節破壞。最近的研究表明，IL-6的產生和分泌可以通過JAK1、TYK2、STAT3和/或STAT4參與一個自分泌反饋回路，推動促炎介質在RA-FLS中的持續激活和分泌[16]。我們通過建立大鼠膠原性關節炎模型，檢測大鼠外周血血清和腹腔巨噬細胞培養上清中IL-6及PGE2的含量，發現炎癥情況下，IL-6、PGE2含量上升，且巨噬細胞明顯向M1型極化，GRK2發生膜轉位，p-STAT3入核增多，p-JAK1、p-STAT3水平升高。提示IL-6、PGE2可通過增強GRK2膜轉位，激活JAK1/STAT3信號通路，促進巨噬細胞向M1型極化，進而增加IL-6、PGE2的分泌，形成一個炎癥循環。而且我們在體外實驗中，發現IL-6聯合PGE2可明顯增強GRK2膜轉位，激活JAK1/STAT3信號通路，原代大鼠腹腔巨噬細胞向M1型極化，p-STAT3入核增加，與體內結果一致。

我們通過動物實驗發現，CP-25可以抑制GRK2膜轉位，增加GRK2與JAK1的共定位結合率，在體外實驗中，發現CP-25可以明顯增加IL-6聯合PGE2刺激巨噬細胞后減少的JAK1與GRK2的共定位結合率，增加GRK2胞質表達量，減少p-JAK1表達量。由此，得出在炎癥情況下，GRK2發生膜轉位，減少與JAK1之間相互作用，降低其對JAK1/STAT3信號通路的抑制作用，JAK1/STAT3信號通路明顯激活，促進炎癥發生發展。CP-25通過抑制GRK2膜轉位，增加GRK2與JAK1之間的相互作用，發揮抑制JAK1/STAT3信號通路的作用。但是GRK2與JAK1之間相互作用的具體方式尚需進一步證實。

綜上所述，本研究證實了CP-25可以通過調控GRK2的活性，發揮調節JAK1/STAT3信號通路的作用，進而調控巨噬細胞的極化。該研究為CP-25成為治療RA的抗炎免疫調節藥物提供理論依據。