白樺酯酸介導STAT3信號通路調控肝纖維化進程

朱 悅，高 璐，廉麗花，南極星，吳艷玲

(延邊大學藥學院，長白山天然藥物研究教育部重點實驗室，吉林 延吉 133002)

肝纖維化是一種可逆病變，主要表征為細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的過度沉積，肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)受病毒性肝炎、酒精等因素刺激，由貯存視黃醇的靜息態變為激活態，其活化與增殖是肝纖維化形成的主要標志[1]。因此，抑制HSCs活化是逆轉肝纖維化的有效途徑之一。信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是STAT家族主要成員之一，作為應答IL-6等炎性因子的主要轉錄因子被首次發現，現被視為慢性炎癥形成中不可或缺的關鍵分子[2]。受異常激活時，STAT3由細胞質轉移至細胞核，進而參與細胞增殖、分化、免疫和炎癥反應等[3]。白樺酯酸(betulinic acid，BA)，是由白樺樹皮中分離獲得一種五環三萜類物質，前期研究初步發現，BA可以改善由硫代乙酰胺誘導肝纖維化，但具體作用機制尚不明確[4]。基于STAT3生物學調控作用，本研究探討BA介導STAT3信號通路改善肝纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞系肝星狀細胞系HSCs和巨噬細胞系Raw264.7為韓國生命工學研究院(韓國大田)Jung-Joon Lee博士慷慨相贈。

1.2 藥品與試劑白樺酯酸(Skyherb Technologies，98%)；小鼠IL-6 ELISA試劑盒(Neobio Science，42SH01)；ALT(A001)、AST(A002)試劑盒(長春匯力)；蘇木精染液(Solarbio，517-28-2)；伊紅染色液(BA4024)、Masson(BA4079B)試劑盒(Baso)；DMEM(C11965500BT)、FBS(900-108)、0.25% Try(15090046)購自Gibco BRL；DMSO(D2650)、青霉素/鏈霉素(I9532、V900929)、LPS(L2880)購自Sigma；Anti-α-SMA(ab5694)、Anti-collagen-1(ab34710)、Anti-MMP-13(ab75606)、Anti-TIMP-1(ab61224)、β-actin(ab8226)購自Abcam；Anti-TLR4(sc-293072)、Anti-p-STAT3(sc-8059)、Anti-STAT3(sc-8019)、Anti-p-LKB1(sc-271924)、Anti-LKB1(sc-374300)、Anti-AMPK(sc-398861)購自Santa Cruz；Anti-p-AMPK(CS-2531)購自Cell Signaling。

1.3 儀器化學成像發光顯色儀(Tanon)；共聚焦掃描顯微鏡(Olympus)；數碼倒置顯微鏡(Nikon)；全自動倒置電泳儀、轉印電泳槽、電泳儀、轉印電泳槽(Bio-Rad)；水平搖床、低溫超速離心機、CO2培養箱(Thermo)；酶標儀(Bio Tek)；凈化工作臺(上海新范醫療器械有限公司)。

1.4 細胞培養HSCs和Raw264.7細胞分別用含有10% FBS和100 U·L-1的青霉素/鏈霉素的DMEM培養，在37 ℃、5%的CO2培養箱中進行傳代培養。

1.5 ELISA檢測上清液IL-6含量Raw264.7細胞接種于6孔板，培養24 h后，給予LPS(1 mg·L-1)孵育細胞不同時間(0、1、3、6、12 h)，收集上清液備用。采用小鼠IL-6 ELISA 試劑盒檢測上清液中IL-6含量，酶標儀測定波長600 nm處的吸光度值，計算出上述上清液中IL-6含量。

1.6 細胞實驗方案Raw264.7細胞接種于6孔板，培養24 h后，給予LPS(1 mg·L-1)孵育12 h，收集上清液備用。為探討BA對活化HSCs抑制作用的時間和劑量關系，HSCs接種于6孔板，培養24 h后，BA(25 μmol·L-1)預處理HSCs 2h后，給予上述上清液孵育0-6 h；BA(0-25 μmol·L-1)預處理HSCs 2 h后，給予上述上清液孵育1 h，收集各分組細胞，提取蛋白，-80 ℃備用。

1.7 Western blot實驗取-80 ℃中提取的蛋白，并用BCA法測定細胞蛋白濃度，取適量進行Western blot檢測，以β-actin為內參，測定蛋白相對表達量。

1.8 動物實驗方案C57BL/6雄性小鼠(購于長春億斯實驗動物科技有限公司)，平均體質量(20±2)g。采用標準化飼料喂養小鼠，待小鼠適應喂養1周后，隨機分為3組，即：正常組、模型組、BA給藥組，每組6只。BA(50 mg·kg-1)灌胃給藥4 d后，除正常組外，每組小鼠腹腔注射10% CCl4(2 mL·kg-1)，24 h后，對小鼠進行安樂死，收集血清和肝臟，部分肝臟浸泡于10%福爾馬林中，部分凍存于-80 ℃備用。

1.9 ALT、AST指標的測定根據試劑盒說明書檢測血清中ALT、AST的水平。

1.10 小鼠肝臟組織病理學觀察取固定于10%福爾馬林溶液的小鼠肝臟，梯度乙醇脫水，石蠟包埋。將蠟塊厚5 μm切片，經HE、Masson染色和STAT3免疫組織熒光染色后，用共聚焦掃描顯微鏡進行肝臟組織病理學觀察。

1.11 統計分析用Quantityone(Bio-Rad公司)分析X-光片中各條帶灰度值進行比較。實驗數據用GraphPad Prism 5.0進行統計分析。

2 結果

2.1 LPS對Raw264.7細胞上清液中IL-6含量的影響本研究為模擬體外HSCs所處肝臟炎癥微環境，采用LPS刺激Raw264.7細胞獲取上清液，再孵育HSCs。由Fig 1可見，隨著時間的延長，上清液中IL-6含量逐漸升高，3 h升高具有統計學意義，12 h時達最高值。

Fig 1 IL-6 contents in medium of Raw 264.7

2.2 BA對活化HSCs中肝纖維化指標的影響由Fig 2可見，BA(25 μmol·L-1)預處理HSCs 2 h后，給予上清液孵育不同時間，BA可以明顯抑制活化HSCs中α-SMA和collagen-I蛋白表達以及TIMP-1/MMP-13比值，呈現時間依賴性。不同濃度BA(0-25 μmol·L-1)預處理HSCs 2 h后，給予上清液孵育1 h，BA可以明顯抑制活化HSCs中α-SMA和collagen-I蛋白表達以及TIMP-1/MMP-13比值，呈現劑量依賴性。

Fig 2 Effect of BA on hepatic fibrosis makers in activated HSCs

2.3 BA對活化HSCs中TLR4信號通路的影響由Fig 3可見，BA(25 μmol·L-1)預處理HSCs 2 h后，給予上清液孵育不同時間，BA可以明顯抑制活化HSCs中TLR4和CD14蛋白表達，呈時間依賴性。不同濃度BA(0-25 μmol·L-1)預處理HSCs 2 h后，給予上清液孵育1 h，BA可以明顯抑制活化HSCs中TLR4和CD14蛋白表達，呈劑量依賴性。

Fig 3 Effect of BA on TLR4 in activated HSCs

2.4 BA對活化HSCs中STAT3信號通路的影響由Fig 4可見，BA(25 μmol·L-1)預處理HSCs 2 h后，給予上清液孵育不同時間，BA可以明顯增強活化HSCs中STAT3磷酸化蛋白表達。不同濃度BA(0-25 μmol·L-1)預處理HSCs 2 h后，給予上清液孵育1 h，BA可以明顯增強活化HSCs中STAT3磷酸化蛋白表達。

Fig 4 Effect of BA on STAT3 in activated HSCs

2.5 BA對活化HSCs中AMPK-LKB1信號通路的影響由Fig 5可見，BA(25 μmol·L-1)預處理HSCs 2 h后，給予上清液孵育不同時間，BA可以明顯增強活化HSCs中AMPK磷酸化蛋白表達并且明顯抑制LKB1磷酸化蛋白表達。不同濃度BA(0-25 μmol·L-1)預處理HSCs 2 h后，給予上清液孵育1 h，BA可以明顯增強活化HSCs中AMPK磷酸化蛋白表達并且明顯抑制LKB1磷酸化蛋白表達。

Fig 5 Effect of BA on AMPK-LKB1 in activated HSCs

2.6 BA改善CCl4誘導小鼠肝纖維化由Fig 6A可見，造模后，模型組小鼠血清中的ALT、AST水平明顯高于正常組。給予BA后，給藥組小鼠血清中的ALT、AST水平明顯降低；由Fig 6B可見，與正常組相比，HE染色顯示，模型組有大量炎性細胞浸潤到匯管區，Masson染色顯示，模型組有大量的膠原纖維增生、交聯，形成纖維間隔，STAT3免疫組織熒光染色顯示，模型組明顯抑制STAT3的陽性表達，給予BA后，給藥組小鼠均有明顯改善。

Fig 6 Effects of BA on related indexes and liver pathological changes in CCl4 induced hepatic fibrosis in mice

3 討論

肝纖維化發生于各種慢性肝臟疾病中，若治療不及時可進展為肝硬化甚至肝癌。肝纖維化發生發展中，炎癥的控制對疾病的治療與轉歸具有關鍵作用。本研究著眼于調控炎癥，結合體內外模擬肝纖維化微環境，研究發現，BA介導STAT3信號通路抑制炎癥因子分泌，進而改善肝纖維化。

非特異性免疫和特異性免疫細胞對肝星狀細胞產生調控作用。IL-6是非特異性免疫調節作用的細胞因子，在肝臟炎癥及肝纖維化中扮演關鍵作用[5]。本研究利用LPS刺激小鼠巨噬細胞Raw264.7產生相關細胞因子IL-6進行后續實驗研究。研究發現，STAT3在肝病的早期階段表現活躍，該信號通路被IL-6激活后，進而磷酸化的STAT3轉移到細胞核，然后激活許多靶基因的轉錄過程，這些基因在誘導和改善肝纖維化方面非常重要[6]。肝纖維化中STAT3表現出“雙刃劍”。有研究發現[7]，STAT3活化能抑制肝纖維化發生，肝細胞特異性STAT3敲除小鼠α-SMA表達明顯高于野生型，表明STAT3敲除促進肝纖維化，且STAT3磷酸化上調依賴于Kupffer細胞分泌IL-6。另有研究表明，STAT3抑制劑STX-0119可阻止HSCs活化來抑制肝纖維化的發展[8]。為了進一步探討STAT3在肝纖維化的作用，研究發現，給予上述上清液后，STAT3磷酸化的表達明顯升高，說明BA可能介導STAT3活化來調控肝纖維化。TLR4是巨噬細胞表面的模式識別受體位于HSCs膜上，能促進肝纖維化和炎癥的發生。LPS在細胞表面由CD14至TLR4呈遞，激活TLR4信號，所以在活化細胞中，TLR4效應蛋白憑借著特異性識別功能，與LPS結合而發生活化[9]。STAT3信號通路能夠被TLR4信號通路信號傳導產物lL-6激活，具有調節細胞增殖、凋亡以及調控炎性反應等多種過程中，發揮關鍵作用[10]。在活化的HSCs中，抑制TLR4-STAT3信號，可調控炎癥反應，參與肝纖維化調控。AMPK是細胞蛋白質合成的能量調節器，多條信號通路調控其磷酸化，AMPK對調節氧化應激及改善炎癥有重要意義，LKB1主要通過調節能量代謝，細胞炎癥來抑制癌癥發生發展，而LKB1-AMPK信號調控可能是肝損傷改善關鍵環節之一[11-12]。BA可明顯改善CCl4升高的血清轉氨酶、組織病理改變，以及STAT3免疫熒光表達。本研究還以LPS刺激Raw264.7細胞，并收集上清液孵育HSCs，模擬體外HSCs所處肝臟炎癥微環境。實驗結果表明，BA可以抑制活化HSCs中ECM以及炎癥因子的表達，從而逆轉肝纖維化。BA介導STAT3信號通路，并阻斷TLR4信號轉導，調控AMPK/LKB1磷酸化，是其改善肝纖維化的潛在機制。

目前臨床上肝纖維化治療以去除病因治療為主，尚缺乏特異性治療藥物及方法。研發作用靶點明確、安全效優的藥物具有重要的臨床價值。本研究結果表明，BA介導STAT3信號通路調控TLR4和AMPK/LKB1磷酸化，進而抑制細胞外基質過度沉積和炎癥因子分泌，為BA基于STAT3改善肝纖維化提供了新的思路和理論支撐。考慮機體內信號通路龐雜及多樣性，仍需要進行更為深入的機制研究。