芥子堿硫氰酸鹽對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞的影響及其機(jī)制

蘇羽屾，曾智銳，榮冬蕓，王 葉，李 丹，袁鄉(xiāng)石，唐姍姍，曹 煜

(貴州醫(yī)科大學(xué)1. 臨床醫(yī)學(xué)院、 2. 附屬醫(yī)院皮膚科、3. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室、4. 貴州省常見(jiàn)慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

皮膚鱗狀細(xì)胞癌簡(jiǎn)稱(chēng)皮膚鱗癌，是一種以角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖為特征的皮膚惡性腫瘤[1]。皮膚鱗癌是全球第二常見(jiàn)的惡性腫瘤，常發(fā)生于老年人長(zhǎng)期日曬損傷的皮膚[2]。大多數(shù)皮膚鱗癌可通過(guò)手術(shù)成功根除，但部分皮膚鱗癌具有較高的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移和死亡率[3]。術(shù)后以紫杉醇、順鉑以及環(huán)磷酰胺的藥物化療的效果并不顯著，研發(fā)新藥物對(duì)治療皮膚鱗癌具有重大意義。

芥子堿硫氫酸鹽(sinapine thiocyanate，ST)是廣泛存在于十字花科植物中的藥用成分，其具有抗氧化、降壓、抗激素代謝、抗衰老以及抗腫瘤等作用[4]。然而，ST對(duì)皮膚鱗癌作用及其機(jī)制尚不明確。本研究擬探究ST對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞A431和Colo-16細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響以及其作用機(jī)制，為臨床抗皮膚鱗癌提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 皮膚成纖維細(xì)胞WS1和Detroit 551以及人皮膚鱗癌A431和Colo-16細(xì)胞購(gòu)自于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2試劑 MEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：CGM110.05)、DMEM高糖培養(yǎng)液(貨號(hào)：CGM103.05)和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，貨號(hào)：SA112.02)購(gòu)自澳洲Cellmax公司；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8；貨號(hào)：40203ES60)購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司； Transwell小室(貨號(hào)：3422)購(gòu)自美國(guó)康寧生物公司；Matrigel膠(貨號(hào)：356234)購(gòu)自美國(guó)BD生物公司；裂解液RIPA(貨號(hào)：R1001)、蛋白酶抑制劑PMSF(貨號(hào)：P0100)和BCA定量試劑盒(貨號(hào)：PC0020)購(gòu)自索萊寶生物公司；SDS-PAGE試劑盒(貨號(hào)：MA0387)購(gòu)自上海美侖公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(貨號(hào)：AS014)及抗鼠(貨號(hào)：AS003)二抗購(gòu)自武漢ABconal公司；兔源性β-catenin多克隆抗體 (貨號(hào)：51067-2-AP)、兔源性Vimentin多克隆抗體(貨號(hào)：10036-1-AP)、兔源性p-AK(S473)多克隆抗體(貨號(hào)：66444-1-lg)、兔源性N-cadherin多克隆抗體(貨號(hào)：22018-1-AP)、兔源性E-cadherin多克隆抗體(貨號(hào)：20874-1-AP)以及鼠源性β-actin單克隆抗體(貨號(hào)：6008-1-Ig) 購(gòu)自武漢Proteintech公司；兔源性AKT多克隆抗體(貨號(hào)：GB11114)和兔源性PCNA多克隆抗體(貨號(hào)：GB11010)購(gòu)自武漢塞維爾有限公司； ST(純度>98%,貨號(hào)：HY-N0450)、紫杉醇(純度>99%,貨號(hào)：HY-B0015)和AKT激動(dòng)劑SC79 (純度>98%,貨號(hào)：HY-18749)均購(gòu)自武漢MCE生物有限公司。以DMSO配制成10 mmol·L-1的母液，儲(chǔ)存于-20 ℃的環(huán)境中。

1.1.3儀器 超凈工作臺(tái)(型號(hào)：CJ-1D)購(gòu)自河南泰斯特儀器有限公司；精密恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：BPH-9042)購(gòu)自上海一恒儀器公司；多功能酶標(biāo)儀(型號(hào)：SpectraMax M3)購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；倒置顯微鏡(型號(hào)：MA200)購(gòu)自日本尼康公司；Western blot凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)：Biorad GelDoc XR)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 皮膚成纖維細(xì)胞WS1和Detroit 551以含10% FBS 的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；人皮膚鱗癌 A431和Colo-16細(xì)胞以含10% FBS 的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細(xì)胞均放置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中。隔日換液，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖 在探究ST和紫杉醇對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞WS1和Detroit 551的細(xì)胞毒性時(shí)，將WS1和Detroit 551細(xì)胞(均4×103個(gè)/孔)種于96孔板上，分別用20 μmol·L-1的ST和紫杉醇以及等體積DMSO處理；在探究ST對(duì)A431和Colo-16 細(xì)胞增殖的影響時(shí)，將A431和Colo-16 細(xì)胞(密度均為4×103個(gè)/孔)種于96孔板上，分別用0(即DMSO處理的對(duì)照組)、5、10和20 μmol·L-1的ST處理，另以20 μmol·L-1的紫杉醇處理作細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照組；在探究AKT激動(dòng)劑SC-79逆轉(zhuǎn)ST對(duì)A431和Colo-16細(xì)胞增殖的影響時(shí)，將A431和Colo-16 細(xì)胞(密度均為4 ×103個(gè)/孔)種于96孔板上。分別用DMSO、20 μmol·L-1的ST及20 μmol·L-1的ST聯(lián)合20 μmol·L-1SC-79處理細(xì)胞。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。24 h后，每孔加入100 μL的CCK-8與DMEM為1 ∶9比例的混合液。3 h后，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取各孔吸光度(OD值)。各組相對(duì)增殖率/%=( 觀察組OD值-空白組OD值) /(對(duì)照組OD 值-空白組OD值) × 100%。

1.2.3克隆平板法檢測(cè)各組細(xì)胞的克隆形成 將A431和Colo-16 細(xì)胞(均1×103個(gè)/皿)種于培養(yǎng)皿上。在探究ST對(duì)A431和Colo-16 細(xì)胞克隆形成影響時(shí)，分別用0(即DMSO處理的對(duì)照組)、5、10和20 μmol·L-1的ST處理；在探究SC-79逆轉(zhuǎn)ST對(duì)A431和Colo-16細(xì)胞克隆形成影響時(shí)，分別用DMSO、20 μmol·L-1的ST及20 μmol·L-1的ST聯(lián)合20 μmol·L-1的SC-79處理。d12， 以多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色和烘箱烤干后，拍照并計(jì)算各組克隆形成數(shù)。

1.2.4劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移 將A431和Colo-16 細(xì)胞(均2×105個(gè)/孔)接種于6孔板。匯合度達(dá)90%時(shí)饑餓細(xì)胞24 h。以200 μL槍頭在細(xì)胞上劃一直線。PBS 洗凈漂浮細(xì)胞后倒置顯微鏡下記錄 0 h劃痕情況。在探究ST對(duì)A431和Colo-16 細(xì)胞遷移影響時(shí)，分別用0(即DMSO處理的對(duì)照組)、5、10和20 μmol·L-1的ST處理細(xì)胞；在探究SC-79逆轉(zhuǎn)ST對(duì)A431和Colo-16 細(xì)胞遷移能力的影響時(shí)，分別用DMSO、20 μmol·L-1的ST及20 μmol·L-1的ST聯(lián)合20 μmol·L-1SC-79處理細(xì)胞。于24 h后再次記錄劃痕情況。ImageJ測(cè)量劃痕0 h和24 h的面積。同一處理組劃痕0 h與24 h的面積差為24 h內(nèi)劃痕愈合面積。相對(duì)遷移率/%=(各藥物處理組24h內(nèi)劃痕愈合的面積/對(duì)照組24 h內(nèi)劃痕愈合的面積)×100%。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲 將300 μL含3×105個(gè)A431和Colo-16 細(xì)胞懸液加入到預(yù)先鋪好Matrigel膠的Transwell上室里。Transwell下室加入700 μL的含10%FBS的培養(yǎng)基。在探究ST對(duì)A431和Colo-16 細(xì)胞侵襲影響時(shí)，分別在上室加入0(即DMSO處理的對(duì)照組)、5、10和20 μmol·L-1的ST；在探究SC-79逆轉(zhuǎn)ST對(duì)A431和Colo-16 細(xì)胞侵襲影響時(shí)，分別在上室加入DMSO、20 μmol·L-1的ST及20 μmol·L-1的ST聯(lián)合20 μmol·L-1的SC-79。于24 h后，用4 %多聚甲醛常溫固定和0.5%的結(jié)晶紫染色。PBS洗凈、烘箱烘干后，每孔隨機(jī)選取4個(gè)視野(放大倍數(shù)100倍)拍照，并計(jì)數(shù)每視野下的侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.6計(jì)算機(jī)分子對(duì)接 在數(shù)據(jù)庫(kù)Protein Data Bank (PDB;有效網(wǎng)址https://www.rcsb.org/)根據(jù)檢索號(hào)“2GU8”下載AKT激酶區(qū)結(jié)構(gòu)的晶體結(jié)構(gòu)；在數(shù)據(jù)庫(kù)PubMed ChemCompound中(有效網(wǎng)址https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/ )下載ST的3D結(jié)構(gòu)。兩者導(dǎo)入SYBYL軟件后利用Ligand dock程序進(jìn)行對(duì)接。Ligand dock步驟如下：(1) AKT蛋白激酶區(qū)晶體結(jié)構(gòu)清除原配體、修復(fù)黏性末端和加氫；(2) 自動(dòng)識(shí)別模式鑒定AKT激酶區(qū)的活性口袋；(3) 以柔性對(duì)接模式對(duì)接ST與AKT的活性口袋，并得出對(duì)應(yīng)的C-score打分 (C -score: 0-5)。當(dāng)C-score：4-5分則可認(rèn)為分子與蛋白能夠穩(wěn)定結(jié)合。

1.2.7蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)AKT/β-catenin信號(hào)通路信號(hào)相關(guān)蛋白的表達(dá) A431和Colo-16細(xì)胞用0 (即DMSO處理的對(duì)照組)、5、10和20 μmol·L-1的ST處理。24 h后，用含 1% PMSF的RIPA裂解細(xì)胞，收集蛋白液后以BCA法定量。蛋白(20μg)在10%的 SDS-PAGE膠中80 V 恒壓電泳2 h后以300 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h至PVDF膜上；5%脫脂奶粉常溫封閉2 h后，分別加入稀釋度為1 ∶1 000的AKT、p-AKT、β-catenin、PCNA、N-cadherin、E-cadherin和β-actin抗體，4 ℃過(guò)夜。TBST洗滌后加入體積稀釋比為1 ∶1 500的二抗。室溫孵育2 h。后滴加ECL曝光液曝光并測(cè)量灰度值。p-AKT以AKT為內(nèi)參，β-catenin、PCNA、N-cadherin和E-cadherin以β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 ST對(duì)正常皮膚成纖維細(xì)胞WS1和Detroit 551毒性較小CCK-8結(jié)果(Fig 1)顯示，DMSO、20 μmol·L-1的ST和紫杉醇處理WS1細(xì)胞24 h，細(xì)胞相對(duì)增殖率分別為 (100.0±3.1)%、(93.2±6.3)% 和(80.1±3.1)%；DMSO、20 μmol·L-1的ST和紫杉醇處理Detroit 551細(xì)胞24 h，細(xì)胞相對(duì)增殖率分別為 (100.0±5.2)%、(88.2±1.7)% 和(55.2±1.9)%；與20 μmol·L-1紫杉醇處理組相比，20 μmol·L-1的ST處理組細(xì)胞增殖率明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示在等濃度下，ST的細(xì)胞毒性較陽(yáng)性化療藥紫杉醇小。

Fig 1 Effects of 20 μmol·L-1 sinapine thiocyanate (ST) and paclitaxel on WS1 and Detroit 551 cell proliferation at 24 h n=18)

2.2 ST抑制人皮膚鱗癌A431和Colo-16細(xì)胞的增殖CCK-8 檢測(cè)結(jié)果(Fig 2)顯示，0 (即DMSO對(duì)照)、5、10和20 μmol·L-1的ST以及20 μmol·L-1紫杉醇處理24 h 后，A431細(xì)胞相對(duì)增殖率分別為(100.1±10.4)%、(81.5±3.3)%、(73.4±5.2)% 、(62.4±10.6)% 和(81.8±3.9)%； Colo-16細(xì)胞相對(duì)增殖率分別為(100.0±3.4)%、(73.6±6.5)%、(64.5±12.8)% 、(59.5±5.1)%和(73.8±2.3)%。與對(duì)應(yīng)細(xì)胞系的對(duì)照組相比，各濃度ST處理組細(xì)胞增殖率均明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)應(yīng)細(xì)胞系的20 μmol·L-1紫杉醇處理組相比，20 μmol·L-1的ST處理組細(xì)胞增殖率減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示，ST抑制人皮膚鱗癌A431和Colo-16細(xì)胞的增殖，且同濃度下較陽(yáng)性藥物紫杉醇明顯。

Fig 2 Effects of different concentrations of sinapine thiocyanate (ST) and 20 μmol·L-1 paclitaxel on human cutaneous squamous cell carcinoma A431 and Colo-16 cell proliferation at 24 h n=18)

2.3 ST抑制人皮膚鱗癌A431和Colo-16細(xì)胞的克隆形成能力平板克隆結(jié)果(Fig 3) 顯示，0(即DMSO對(duì)照)、5、10和 20 μmol·L-1的ST處理組中A431細(xì)胞克隆形成數(shù)依次為(250±8) 個(gè) 、(180±10 ) 個(gè) 、(120±18) 個(gè)和(80±8) 個(gè)；0、5、10 和20 μmol·L-1的ST處理組中Colo-16細(xì)胞克隆形成數(shù)依次為(170±8) 個(gè)、(150±10) 個(gè)、( 80±3 ) 個(gè)和(50±13)個(gè)。與對(duì)應(yīng)細(xì)胞系的對(duì)照組相比，各濃度ST處理組克隆形成數(shù)均明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示ST明顯抑制A431和Colo-16細(xì)胞的克隆形成能力。

Fig 3 Effects of different concentrations of sinapine thiocyanate (ST) on colony formation of human cutaneous squamous cell carcinoma A431 and Colo-16 cells in vitro n=3)

2.4 ST抑制人皮膚鱗癌A431和Colo-16細(xì)胞的遷移劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Fig 4)顯示，0(即DMSO對(duì)照)、 5、10和20 μmol·L-1的ST處理 24 h 后，A431細(xì)胞相對(duì)遷移率分別為(100.0±6.4)%、(44.3±4.2)%、(40.7±8.6)%和(5.9±2.8)%； Colo-16細(xì)胞相對(duì)遷移率分別為(100.0±9.6)%、(29.8±5.7)%、(27.4±4.4)%和(13.2± 3.1)%。與對(duì)應(yīng)細(xì)胞系的對(duì)照組相比，各濃度ST處理組細(xì)胞相對(duì)遷移率均明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示ST抑制A431和Colo-16細(xì)胞的遷移能力。

Fig 4 Effects of sinapine thiocyanate (ST) on migration of cutaneous squamous cell carcinoma cells A431 and Colo-16 by wound healing assay (×40) n=3)

2.5 ST抑制人皮膚鱗癌A431和Colo-16細(xì)胞的侵襲Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Fig 5)顯示，0(即DMSO對(duì)照)、5、10和20 μmol·L-1的ST處理24 h 后，A431細(xì)胞每視野下侵襲過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)為(78±5)、(60±8)個(gè)、( 38±4) 個(gè)和(10±6) 個(gè)；Colo-16侵襲過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)為(400±31)個(gè)、(210±59)個(gè)、( 110±14) 個(gè)和(40±8)個(gè)。與對(duì)應(yīng)細(xì)胞系的對(duì)照組相比，各濃度ST處理組細(xì)胞的每視野下侵襲過(guò)膜細(xì)胞數(shù)均明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示ST抑制A431和Colo-16細(xì)胞的侵襲能力。

Fig 5 Effects of sinapine thiocyanate (ST) on invasion of A431 and Colo-16 cutaneous squamous cell carcinoma cells using Transwell assay (magnification times, ×100) n=3) *P<0.05 vs control.

2.6 ST穩(wěn)定結(jié)合AKT激酶區(qū)的活性口袋分子對(duì)接結(jié)果(Fig 6)顯示，ST能與AKT蛋白激酶區(qū)的活性口袋穩(wěn)定結(jié)合(C-score=5)，并“包埋”在活性口袋內(nèi)。提示ST可能會(huì)影響AKT蛋白的活化及其下游通路。

Fig 6 Stable binding of sinapine thiocyanate (ST) to the active pocket of AKT shown by computer molecular docking

2.7 ST對(duì)AKT、p-AKT (S473)、β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、PCNA表達(dá)的影響用不同濃度(0、5、10、20 μmol·L-1)的ST處理A431和Colo-16細(xì)胞后，Western blot結(jié)果(Fig 7)顯示，與各細(xì)胞系的對(duì)照組(即0 μmol·L-1的ST組)相比，各濃度處理組p-AKT (S473)、β-catenin、N-cadherin、Vimentin和PCNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯減少，E-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示ST抑制AKT/β-catenin信號(hào)通路。

Fig 7 Effects of sinapine thiocyanate (ST) on expression of AKT, p-AKT (S473), β-catenin, E-cadherin, N-cadherin, Vimentin and PCNA protein in A431 and Colo-16 cells by Western blot n=3)

2.8 SC79減輕ST介導(dǎo)的皮膚鱗癌細(xì)胞增殖和克隆形成抑制作用為進(jìn)一步探討，ST對(duì)皮膚鱗癌的作用是否通過(guò)抑制AKT/β-catenin通路介導(dǎo)的，應(yīng)用AKT的激動(dòng)劑SC79進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)。CCK-8結(jié)果(Fig 8A)顯示, DMSO、 20 μmol·L-1的ST以及20 μmol·L-1的ST聯(lián)合20 μmol·L-1的SC-79處理組的A431細(xì)胞增殖率分別為(100.0± 4.4)%、(62.6±2.8 )%和(84.5±6.5)%；DMSO、20 μmol·L-1的ST以及20 μmol·L-1的ST聯(lián)合20 μmol·L-1的SC-79處理組的Colo-16細(xì)胞增殖率分別為(99.3±3.8)%、(57.8 ±1.5)% 和(78.9±7.1)%。與對(duì)應(yīng)細(xì)胞系的單獨(dú)20 μmol·L-1的ST處理組細(xì)胞相比，聯(lián)合組細(xì)胞增殖率均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，克隆平板結(jié)果(Fig 8B，C)顯示，DMSO、 20 μmol·L-1的ST以及20 μmol·L-1的ST聯(lián)合20 μmol·L-1的SC-79處理組A431細(xì)胞的克隆形成數(shù)分別為(213±14)個(gè)、(62±7 )個(gè)和( 144±13)個(gè)；DMSO、20 μmol·L-1的ST以及20 μmol·L-1的ST聯(lián)合20 μmol·L-1的SC-79處理組Colo-16細(xì)胞的克隆形成數(shù)分別為(133 ±14)個(gè)、(36±7)個(gè)和( 78 ±19)個(gè)。與對(duì)應(yīng)細(xì)胞系的單獨(dú)20 μmol·L-1的ST處理組細(xì)胞相比，聯(lián)合組細(xì)胞克隆形成數(shù)均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示AKT激動(dòng)劑SC79能減輕ST對(duì)皮膚鱗癌增殖和克隆形成的抑制作用。

Fig 8 The inhibitory effects of sinapine thiocyanate (ST) on A431 and Colo-16 cell proliferation and colony formation reversed by AKT activator SC79

2.9 SC79減輕ST介導(dǎo)的皮膚鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲形成抑制作用劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Fig 9A)顯示, DMSO、 20 μmol·L-1的ST以及20 μmol·L-1的ST聯(lián)合20 μmol·L-1SC-79處理組的A431細(xì)胞遷移率分別為(100.0±7.4)%、(5.83±3.2)%和(88.39±2.68)%；DMSO、20 μmol·L-1的ST以及20 μmol·L-1的ST聯(lián)合20 μmol·L-1SC-79處理組的Colo-16細(xì)胞的遷移率分別為(100.0±8.4)%、(15.46±1.61)%和(91.04±8.36)%。與對(duì)應(yīng)細(xì)胞系的單獨(dú)20 μmol·L-1的ST處理組細(xì)胞相比，聯(lián)合組細(xì)胞遷移率均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Fig 9B)顯示，DMSO、 20 μmol·L-1的ST以及20 μmol·L-1的ST聯(lián)合20 μmol·L-1SC-79處理組A431細(xì)胞的每視野下的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(138 ±12)個(gè)、(28± 6 )個(gè)和(109 ±10)個(gè)；DMSO、 20 μmol·L-1的ST以及20 μmol·L-1的ST聯(lián)合20 μmol·L-1SC-79處理組Colo-16細(xì)胞的每視野下的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(409±16)個(gè)、(63± 9 )個(gè)和(385 ±12)個(gè)。與對(duì)應(yīng)細(xì)胞系的單獨(dú)20 μmol·L-1的ST處理組細(xì)胞相比，聯(lián)合組侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示AKT激動(dòng)劑SC79能減輕ST對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。

Fig 9 The inhibitory effects of sinapine thiocyanate (ST) on A431 and Colo-16 cell migration and invasion reversed by AKT activator n=3)

3 討論

皮膚鱗癌是一種預(yù)后較差的惡性腫瘤。目前，皮膚鱗癌的臨床治療方法主要有皮膚外科干預(yù)治療及放化療[5]。然而，部分皮膚鱗癌具有較高的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移和死亡率[6]。術(shù)后以紫杉醇、順鉑等藥物化療效果并不顯著，且副作用較多。

近年來(lái)，多種中藥及其有效成分對(duì)包括皮膚鱗癌在內(nèi)的疾病展示了良好的療效。如芳姜黃酮能夠抑制A375人黑素瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡[7]；黃芩苷能夠抑制皮膚鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移[8]。芥子堿類(lèi)成分廣泛存在于十字花科藥用植物中，常以硫氰酸鹽的形式穩(wěn)定存在的藥物活性成分[9]。因此，也稱(chēng)為芥子堿硫氫酸鹽(ST)，其具有抗氧化、降壓、抗激素代謝、抗衰老以及抗腫瘤等作用[10]。有研究表明，苦參和ST聯(lián)合治療對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷所致的血栓形成前狀態(tài)的具有保護(hù)作用[11]。Fan等[4]表明凝膠狀態(tài)ST可以通過(guò)透皮制劑對(duì)哮喘疾病進(jìn)行治療。本研究通過(guò)CCK-8發(fā)現(xiàn)，同濃度下，相比于化療藥紫杉醇，ST對(duì)正常皮膚成纖維細(xì)胞毒性較小，且對(duì)皮膚鱗癌的A431和Colo-16的增殖抑制作用更為明顯。進(jìn)一步應(yīng)用克隆形成、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ST抑制人皮膚鱗癌A431和Colo-16細(xì)胞的克隆形成、遷移和侵襲。由此提示，ST是一種具有潛力的抗皮膚腫瘤藥物。

蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)有2個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為催化結(jié)構(gòu)域的Thr308位點(diǎn)和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的Ser473位點(diǎn)。兩個(gè)位點(diǎn)均被磷酸化才能使AKT充分活化[12]。活化的AKT在介導(dǎo)細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲和凋亡等方面發(fā)揮著重要作用[13]。有研究發(fā)現(xiàn)AKT 和p62在皮膚外陰鱗狀細(xì)胞癌中有表達(dá)明顯增加，且與患者的不良預(yù)后相關(guān)[14]。同樣，張娟等[15]發(fā)現(xiàn)AKT的活性在皮膚鱗癌中異常激活。因此，靶向AKT是治療皮膚鱗癌的一種可行策略。在本研究中，發(fā)現(xiàn)ST可以穩(wěn)定結(jié)合AKT蛋白激酶區(qū)的活性口袋。因此，推測(cè)ST影響AKT蛋白的活性以及下游通路的活化。與推測(cè)一致， Western blot發(fā)現(xiàn)，ST處理后，AKT蛋白的活化形式p-AKT (S473)的表達(dá)明顯減少。已有文獻(xiàn)表明，活化的AKT蛋白，可以通過(guò)多種途徑，增加β-catenin蛋白的表達(dá)及其功能，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)功能[16-17]。為此，Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)β-catenin及其下游靶蛋白的表達(dá)。結(jié)果提示，ST顯著抑制β-catenin及其下游靶蛋白N-cadherin、Vimentin和PCNA的表達(dá)，增加E-cadherin蛋白的表達(dá)。此外發(fā)現(xiàn)，AKT激動(dòng)劑SC79能夠顯著減輕ST介導(dǎo)的皮膚鱗癌細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，ST可通過(guò)抑制AKT/β-catenin通路減少皮膚鱗癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。ST具有良好的抗皮膚鱗癌活性，有望成為臨床治療皮膚鱗癌的有效藥物。