消瘤止痛凝膠制備工藝的優(yōu)化

李 江孫韶陽王 飄陳凌云*李爭艷*

（1.昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明650500； 2.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650500； 3.青島天成中藥飲片有限公司，山東 青島266000）

消瘤止痛方由土茯苓、山慈菇、姜黃、蜈蚣、土鱉蟲、北細(xì)辛、肉桂、冰片、海風(fēng)藤、干姜、川烏、丁香、石楠藤13 味藥材組成，功效化痰散結(jié)、活血止痛、解毒消瘤，主治腫瘤所致疼痛，該方原以膏劑入藥，使用時易對衣物產(chǎn)生油污。方中揮發(fā)油與其療效密切相關(guān)，如姜黃揮發(fā)油可抑制癌細(xì)胞［1］，其所含芳姜黃酮可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋零［2］；丁香揮發(fā)油具有抗炎、鎮(zhèn)痛效果［3］，其所含丁香酚對癌相關(guān)成纖維細(xì)胞有抑制作用［4］；北細(xì)辛所含揮發(fā)油具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用［5?6］，但全方制備工藝并未提取上述成分。為了保障臨床療效，本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)優(yōu)化消瘤止痛方揮發(fā)油提取工藝，同時將該方制為使用便捷、患者順應(yīng)較好的水溶性基質(zhì)凝膠，從而促進(jìn)其臨床推廣。

為使消瘤止痛凝膠制備工藝中各主、客觀評價指標(biāo)的權(quán)重盡可能合理，本實(shí)驗(yàn)采用AHP?CRITIC混合加權(quán)法對各指標(biāo)進(jìn)行賦權(quán)，相對于AHP、Delphi、CRITIC 等單一賦權(quán)方法更適用。再通過D?Optimal 設(shè)計(jì)優(yōu)化該制劑制備工藝，以期為其進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100 高效液相色譜系統(tǒng)（美國Agilent公司）；Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，迪馬科技有限公司）；T?1000 型電子天平［美國雙杰兄弟（集團(tuán)）有限公司］；AB265?S 電子分析天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；PH 計(jì)（奧豪斯儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 落新婦苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號11798?201504，純度93.9%）。海風(fēng)藤、石楠藤、細(xì)辛、干姜、姜黃、丁香、肉桂、川烏、土茯苓、山慈菇、蜈蚣、土鱉蟲、冰片均由昆明市中醫(yī)醫(yī)院提供（有檢驗(yàn)報告），經(jīng)專家鑒定為正品。卡波姆980（青島天力源生物科技有限公司）；甘油（天津市申泰化學(xué)試劑有限公司）；吐溫80（天津市博迪化工有限公司）。甲醇為色譜純；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝優(yōu)化

2.1.1 揮發(fā)油 以出油率、干膏得率計(jì)算綜合評分（Z1），考慮到本實(shí)驗(yàn)以提取揮發(fā)油為主，故設(shè)定兩者權(quán)重系數(shù)分別為0.7、0.3，公式為Z1＝（出油率／最大出油率）×70 ＋（干膏得率／最大干膏得率）×30。其中，出油率＝（揮發(fā)油質(zhì)量／飲片質(zhì)量）×100%，干膏得率＝（已恒重的膏質(zhì)量／對應(yīng)飲片質(zhì)量）×100%。

按處方比例取3 份含揮發(fā)油的飲片（海風(fēng)藤、石楠藤、細(xì)辛、干姜、姜黃、丁香、肉桂、川烏，雖然川烏不含揮發(fā)油，但并入揮發(fā)油提取中進(jìn)行先煎），每份70 g，加10 倍量水，于0～75 min內(nèi)每15 min 測定1 次吸水率，發(fā)現(xiàn)最佳浸泡時間為60 min，平均吸水率為108.08%（RSD ＝2.49%）。以Z1為評價指標(biāo)，單因素試驗(yàn)考察提取時間（1、2、3、4、5 h）、料液比（1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30）對揮發(fā)油提取的影響，結(jié)果見圖1，可知最佳提取時間為3 h，料液比為1 ∶20，出油率（n＝2）為3.52%。

圖1 各因素對揮發(fā)油提取工藝的影響Fig.1 Effects of various factors on the extraction process for volatile oils

2.1.2 藥材 按處方比例取3 份不含揮發(fā)油的飲片（土茯苓、山慈菇、蜈蚣、土鱉蟲），每份40 g，加10 倍量水，于0～75 min 內(nèi)每15 min 測定1 次吸水率，確定最佳浸泡時間為45 min，吸水率為105.02%（RSD＝4.27%）。

以干膏得率、落新婦苷于飲片至水提液中的轉(zhuǎn)移率計(jì)算綜合評分（Z2），其中干膏得率＝（已恒重膏質(zhì)量／對應(yīng)飲片質(zhì)量）×100%，落新婦苷轉(zhuǎn)移率＝（提取液中落新婦苷含量／飲片中落新婦苷含量）×100%（飲片中落新婦苷含量按2020 年版《中國藥典》方法測定），兩者權(quán)重系數(shù)分別為0.486、0.514。

取落新婦苷對照品適量，加甲醇制成100 μg／mL溶液，按處方比例取不含揮發(fā)油的飲片80 g，提取，合并濾液，濃縮，定容至100 mL，移取10 mL，加等體積水飽和正丁醇萃取4 次，萃取液減壓回收溶劑至干，加甲醇定容至10 mL，濾過，作為供試品溶液，同法制備陰性樣品溶液。分析條件為C18色譜柱；流動相甲醇?0.5% 冰醋酸（28 ∶72）；體積流量1 mL／min，柱溫30 ℃；檢測波長291 nm；進(jìn)樣量10 μL。以落新婦苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝22.98X＋4.84（r＝0.999 9），在20.85～208.46 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，精密度、穩(wěn)定性（16 h 內(nèi)）、重復(fù)性試驗(yàn)所得RSD 均＜2.0%，平均加樣回收率（n＝6）為104.10%，RSD為2.04%。圖2 顯示，該方法專屬性良好。

圖2 落新婦苷HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of astilbin

結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)，選擇料液比（A1）、提取時間（B1）、提取次數(shù)（C1）作為影響因素，Z2作為評價指標(biāo)，3 因素3 水平正交試驗(yàn)優(yōu)化水提工藝，結(jié)果見表1，方差分析見表2。由此可知，各因素影響程度依次為C＞B＞A，其中C有顯著影響（P＜0.05），并且該因素K3、K2相差較小，從實(shí)際生產(chǎn)成本考慮，選擇提取2 次。最終確定，最優(yōu)工藝為料液比1 ∶10，提取時間1.5 h，提取次數(shù)2 次。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.1 Design and results of orthogonal tests

表2 正交實(shí)驗(yàn)方差分析Tab.2 Analysis of variance for orthogonal tests

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按“2.1”“2.2”項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測得含揮發(fā)油藥材平均干膏得率為13.57%（RSD ＝1.53%），出油率為3.55%（RSD ＝0.99%），而不含揮發(fā)油藥材兩者分別為16.24%（RSD ＝3.76%）、47.70%（RSD ＝2.96%），表明該工藝穩(wěn)定可靠。

2.2 濃縮、干燥工藝優(yōu)化 以提取液?濃縮液、濃縮液?干膏環(huán)節(jié)單元的落新婦苷保留率為指標(biāo)，分別對常壓、減壓濃縮和干燥工藝進(jìn)行考察，測定落新婦苷平均保留率，公式為保留率＝（濃縮或干燥后中間體中對應(yīng)1 g 土茯苓所含落新婦苷含量／濃縮或干燥前中間體中對應(yīng)1 g 土茯苓所含落新婦苷含量）×100%，結(jié)果見表3。由此可知，減壓濃縮［（80± 5）℃、（0.07 ± 0.01）MPa］、減壓干燥［（80±5）℃、（0.06±0.01）MPa］效果最佳。

表3 落新婦苷保留率測定結(jié)果（n＝2）Tab.3 Results of retention rate determination of astilbin（n＝2）

2.3 成型工藝優(yōu)化

2.3.1 評價指標(biāo) 以凝膠黏度、外觀性狀、載藥量、保濕性為評價指標(biāo)（Z3），進(jìn)行成型工藝優(yōu)化。

2.3.2 權(quán)重系數(shù)計(jì)算

2.3.2.1 AHP 法 選擇黏度、外觀性狀、載藥量、保濕性作為評價指標(biāo)，其中前三者采用主觀評分的方式評價，各指標(biāo)重要性依次為黏度＝外觀性狀＞載藥量＞保濕性，建立成對對比矩陣A，將矩陣中各數(shù)值除以對應(yīng)列的和，并對所得結(jié)果各行求和，得到單列結(jié)果，再將該列結(jié)果各數(shù)值除以列和，得到矩陣B［7］，矩陣中各數(shù)值至上而下，分別對應(yīng)黏度、外觀性狀、載藥量、保濕性，權(quán)重（Wj）分別為0.354、0.354、0.161、0.131。具體如下。

再通過AHP 法計(jì)算指標(biāo)權(quán)重的一致性檢驗(yàn)，按λ ＝（1／n）［（AB）i／Bi］、CI ＝（λ－ n）／（n－1）、CR ＝CI／RI分別求得最大特征根λ為4.021，一致性指標(biāo)CI為0.007，一致性比率CR為0.008 ＜0.1（n＝4 時，隨機(jī)一致性指標(biāo)RI＝0.90），表明所得權(quán)重可靠性較高。

2.3.2.2 CRITIC 法 對表3 各指標(biāo)的量值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到標(biāo)準(zhǔn)矩陣，公式為［（指標(biāo)值－最小指標(biāo)值）／（最大指標(biāo)值－最小指標(biāo)值）］ ×100%。通過SPSS 18.0 軟件進(jìn)行因子分析，求得相關(guān)系數(shù)矩陣C。具體如下。

再計(jì)算對比強(qiáng)度（σj）、沖突性（Rj）、綜合權(quán)重（Hj）、權(quán)重（Wj）［8］，公式分別為σj＝結(jié)果見表4。由此可知，黏度、外觀性狀、載藥量、保濕性的的權(quán)重系數(shù)分別為0.306、0.185、0.249、0.260。

表4 各指標(biāo)權(quán)重的相關(guān)參數(shù)Tab.4 Related parameters for the weights of various indices

2.3.2.3 AHP?CRITIC 混合加權(quán)法 采用混合加權(quán)法計(jì)算各指標(biāo)復(fù)合權(quán)重系數(shù)（Wf），公式為Wf＝Wj?AHPWj?CRITIC／∑Wj?AHPWj?CRITIC，測得黏度、外觀性狀、載藥量、保濕性Wf分別為0.437、0.264、0.162、0.137，再通過SPSS 18.0 軟件對AHP、CRITIC 法所得Wj進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)相關(guān)系數(shù)為－0.113，表明2 種賦權(quán)方法存在較大差異。同時，對表6 中AHP、CRITIC、AHP?CRITIC 法所得綜合評分進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)AHP 與CRITIC、AHP 與 CRITICAHP?CRITIC、CRITIC 與 AHP?CRITIC 的相關(guān)系數(shù)分別為0.969、0.992、0.955，表明3 種賦權(quán)方法具有一致性，所得Wf可靠［9?10］。

2.3.3D?Optimal 設(shè)計(jì) 結(jié)合文獻(xiàn)中的凝膠基礎(chǔ)處方和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出揮發(fā)油、干膏、冰片總質(zhì)量（A2）為17～27 g（三者按處方比例使用，比例17 ∶2 ∶63），Tween?80 用量（B2）為0.5～1.5 g，甘油用量（C2）為5～10 g，卡波姆980（先用50 mL 20% 丙二醇溶脹14 h）用量（D2）為2～4.6 g。按上述方法溶脹卡波姆980，并加入Tween?80、甘油攪拌均勻，再依次加入干膏、冰片、揮發(fā)油、尼泊金乙酯（固定其用量為0.40 g），研缽研勻，加三乙醇胺調(diào)pH 至7.0±0.5（測定pH 時將凝膠調(diào)配為10%溶液），制備消瘤止痛凝膠。

以凝膠黏度、外觀性狀、載藥量、保濕性的綜合評分（Z3）為評價指標(biāo)（表5），通過Design?Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行D?Optimal 設(shè)計(jì)，計(jì)算凝膠載藥量，公式為載藥量＝（A2／制得凝膠總質(zhì)量）×100%，結(jié)果見表6，結(jié)合方差分析可知模型P＜0.000 1，失擬項(xiàng)P＝0.598 ＞0.05，R2＝0.995 0，回歸方程為Z3＝62.00A＋48.06B＋58.99C＋77.96D－8.41AB＋51.20AC＋58.96AD＋43.17BC＋72.73BD＋64.10CD－ 80.38ABC＋814.66ABD－ 258.35ACD－434.63BCD。最終確定，最優(yōu)處方為揮發(fā)油、干膏、冰片總質(zhì)量19.96 g，Tween?80 用量0.77 g，甘油用量5.00 g，卡波姆980 用量3.12 g，Z3為108.85 分。3 批驗(yàn)證試驗(yàn)中，Z3平均值為112.63分（RSD＝5.42%），與預(yù)測值108.85 分接近（相對誤差3.47%），表明該處方及制備方法穩(wěn)定可靠［11?12］。

表5 各評價指標(biāo)的評分標(biāo)準(zhǔn)Tab.5 Scoring standards for various evaluation indices

表6 D?Optimal 設(shè)計(jì)結(jié)果Tab.6 Results of D?Optimal design

3 討論與結(jié)論

消瘤止痛方含揮發(fā)油藥味較多，如石楠藤、干姜、姜黃等含輕油，肉桂、丁香含重油，同時，不含揮發(fā)油的藥味長時間加熱時不利于有效成分的保留（如君藥土茯苓中的落新婦苷），故本實(shí)驗(yàn)未全方提取揮發(fā)油，而是將提取揮發(fā)油后所剩藥渣與方中水提藥味合并后考察水提工藝，從而保障本方療效。方中蜈蚣、土鱉蟲、山慈菇、海風(fēng)藤、石楠藤在2020 年版《中國藥典》 中未收錄“含量測定”項(xiàng)，暫不作為評價指標(biāo)；丁香、肉桂含有揮發(fā)油，故不宜作為評價指標(biāo)；細(xì)辛中細(xì)辛酯素、干姜中6?姜辣素、姜黃中姜黃素在水提液中的峰面積過小，也不適合列入評價指標(biāo)；2020 年版《中國藥典》 規(guī)定，川烏中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿總含量不得低于0.01%，而本方中該藥材用量僅為全方的1／12，經(jīng)計(jì)算三者總含量均不足全方總量的十萬分之一，數(shù)值過低導(dǎo)致也無法將其作為評價指標(biāo)；冰片不參與提取，最終確定君藥土茯苓中落新婦苷為評價指標(biāo)。另外，在提取過程中落新婦苷平均轉(zhuǎn)移率偏低，僅為47.70%，可能與該成分熱不穩(wěn)定，并與方中其他藥味所含成分發(fā)生反應(yīng)有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步探索。

由于成型工藝中干膏、揮發(fā)油、冰片的投料比是固定的（由處方?jīng)Q定），故本實(shí)驗(yàn)將三者總投料量作為一個影響因素，并結(jié)合凝膠基質(zhì)處方中各物料用量作為D?Optimal 設(shè)計(jì)中的自變量進(jìn)行優(yōu)化。D?Optimal 設(shè)計(jì)可在具有多個自變量的情況下減少試驗(yàn)次數(shù)，同時使結(jié)果更合理，相較于正交設(shè)計(jì)更為可靠，與星點(diǎn)設(shè)計(jì)相比也更加便捷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對消瘤止痛凝膠提取、濃縮、干燥、成型工藝進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并篩選出穩(wěn)定的制備工藝，可為該制劑的劑型改進(jìn)、臨床推廣、生產(chǎn)工藝規(guī)程制定奠定基礎(chǔ)。